细胞研究篇1

集落实验和RTPCR实验结果显示：在实验所采用的颗粒浓度范围内，Fe3O4纳米颗粒对HeLa细胞基本没有细胞毒性.对于核苷酸修复通路有缺陷的XPF细胞，Fe3O4纳米颗粒可以抑制该细胞的生长和分裂，表现出一定的细胞毒性.Fe3O4纳米颗粒可以使XPF细胞内CHEK1，RPA1，RPA2，RPA3基因转录比较明显地增加.CHEK1基因转录的增加可以使XPF细胞的细胞周期停止，从而抑制其分裂和生长.而RPA1，RPA2，RPA3基因转录增加暗示了Fe3O4纳米颗粒对XPF细胞产生某种损害.但究竟是何种损害需要进一步研究.本文的研究结果表明：Fe3O4纳米颗粒在肿瘤诊断、治疗上的应用必须谨慎，对有先天核苷酸剪切修复通路突变的肿瘤患者，就不能使用Fe3O4纳米颗粒，否则会对患者造成额外的损害.

参考文献

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细胞研究篇2

体内糖平衡主要由胰岛素(INS)控制，胰岛β细胞可释放INS调节餐后的血糖，也可通过β细胞的增长适应长期的INS需求，如果其中任一环节发生障碍，引起绝对或相对INS缺乏，则可引发糖尿病。有关INS的生物合成和释放调节已进行了广泛的研究，但对于β细胞再生研究直到近年方引起重视。

非INS依赖型糖尿病(NIDDM)发病机理并不十分清楚。但有证据表明：对葡萄糖的刺激反应INS分泌减少和β细胞增长不足易患此病〔1〕，而老年人存在胰岛再生能力低下，可能与糖尿病患病率高有关。Ⅰ型糖尿病是自身免疫引起β细胞损伤，致失代偿，此病初发时常有INS的短期恢复，说明缺损的胰岛细胞竭力满足体内INS的需求。研究β细胞增长的调节将有助于了解糖尿病发病机理，对糖尿病的治疗也将有重要的意义。本文对β细胞增长的难度，如何增长，调节因素等问题的研究做一简要综述。

1β细胞生长能力与糖尿病

目前常用C57BL/6J小鼠作为研究NIDDM的遗传性糖尿病动物模型，该种系1988年由美国Duke大学培育成功，为单糖尿病遗传基因病鼠。此鼠在正常饲料喂养下不发病，在高脂肪(33%)，高单糖(38%)，低纤维素(＜3%)饲料诱导下，经过4w(由4周龄开始至8周龄)发病。它与C57BL/KSJ鼠种的胰岛再生能力不同，即用葡萄糖刺激C57BL/6J小鼠胰岛，可增殖的细胞比率较C57BL/KSJ的多一倍。当发病时，C57BL/6J小鼠出现中度糖尿病、INS抵抗、肥胖和胰岛过度增生，C57BL/KSJ的早期症状与前者相似，但随后出现重度糖尿病，体重下降，β细胞破坏及死亡，这些观察表明胰岛素细胞再生能力决定了糖尿病的表现形式，支持人类Ⅱ型糖尿病是多因素致病的遗传观点。

另有证据表明，NIDDM患者的β细胞总量比相应对照组(体重匹配)少〔1〕。有人提出一种假设，认为肥胖者由于外周INS抵抗，β细胞总量应适应性地增加，假如β细胞没有增长，INS产生将不足，便会引发糖尿病。由于胰岛有生产INS的较大贮备，β细胞的适度减少不会引发糖尿病，然而长期持续增加功能负载，致β细胞总量减少，INS释放会逐渐减少。另外，胰岛也存在质的异常，如NIDDM患者血中INS原/INS比值增高，是否通过β细胞的增殖可遮掩质的异常也是今后寄望的研究课题。由此可见，除了INS分泌、抵抗外，还应研究β细胞的生长能力。

β细胞增长能力与Ⅰ型糖尿病的发病关系不大，它主要因自身免疫损伤胰岛，发病初期经历了INS的合成由增多到减少的变化过程，表明胰岛为满足机体对INS的需求进行了再生的努力，因不能充分代偿，必然引发糖尿病。如及时用免疫抑制剂中止β细胞损害，可不致于发生严重的糖尿病症状。由于β细胞可再生的部分有限，此种治疗需在自身免疫损伤β细胞的初期进行。

2胰岛β细胞的生长

人到成年以后，有些细胞仍然进行着细胞分型，如表皮细胞、血细胞，有的不再进行分裂增殖，如神经细胞，即损伤后不能通过增殖来修复；有些细胞正常时并不进行分裂增殖，但当损伤后，细胞可旺盛地进行分裂，达到修复目的，如肝细胞。胰岛细胞平时也是处于相对静止期，并不分裂，但当损伤后需修复时只有很少一部分细胞可以进行分裂，且随年龄增长，可增殖细胞的部分也逐步减少。

β细胞增殖周期分裂过程同其它细胞相似，由G1期、S期、G2期和M期组成，整个细胞周期时间为14.9h，平时处于相对稳定的G0期。分析葡萄糖对β细胞增殖的作用，见细胞周期各时期变化与葡萄糖无关，说明葡萄糖是调节部分细胞进入“可增殖部分proliferativecompart,PC)”，使之进入细胞循环进行增殖。这与一般的调节机制相同，即进入细胞周期后是由与启始刺激因子不同的一系列调节物调节。用不同刺激条件观察细胞周期，可估计最大PC，即能够再生的部分细胞，胎鼠的胰岛约为10%，到成年时减到不足3%，而剩余大部分胰岛处于不可逆的G0期，不能进行细胞增殖〔5〕。以上研究说明胰岛再生能力受能够再生细胞的存有量和刺激因子的双方约束。

3β细胞的增长方式〔2，3〕

β细胞的增长包括三方面：由β细胞前体衍变，即增生或化生；β细胞体积增大——肥大，β细胞数目增多——再生。

给正常成年大鼠注射链脲佐菌素(STZ)破坏胰岛，可造成永久性糖尿病模型，而给刚出生的大鼠注射STZ14d后血糖恢复正常，此时可见管状上皮存在，含有INS的细胞，另外胰岛随胰管的生长而增长，表明胰岛细胞可增生。虽然缺乏β细胞前体的形态标志物，不能直接测定前体，但间接证据表明存在在此过程。

关于β细胞肥大的研究较少，它主要由营养素刺激，适应INS增加的需求，致β细胞体积增大，INS产生增多，但在β细胞生长方面此种方式有限，只是部分质(INS分泌增多)上的修复。

4β细胞生长的调节因子

4.1营养素调节胎儿和新生儿胰岛发育变化较大，尤其是出生后受营养素的刺激，在妊娠20d前的胎鼠胰岛主要由混合必需氨基酸刺激再生，葡萄糖不起作用，而妊娠末期为对葡萄糖敏感，氨基酸降到次要地位。此种转变似乎是为出生后作准备，何种因子调节此变化尚不清楚。氨基酸的促进作用，可持续到成年，但不再起主导作用〔4〕。

D-葡萄糖、D-甘露糖或混合必需氨基酸由β细胞代谢刺激再生，用甘露庚酮糖抑制葡萄糖代谢，刺激作用消失。不能代谢的糖类，如L-葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖或果糖不能促进再生。这些研究表明，β细胞再生与INS合成和释放一样，与刺激物的代谢相关。也有报道游离脂肪酸可促进再生。

4.2生长因子的调节现已知体内含有一组多肽生长因子，其结构与激素相似，通过特异性膜受体传递生物学信息，称之为生长因子。根据生长因子产生细胞和支配细胞间的关系，主要有下列三种模式：(1)内分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子，通过血液携带作用于远处的细胞；(2)旁分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子作用于邻近的细胞；(3)自分泌型：产生生长因子的细胞所分泌的生长因子作用于细胞本身，其本身有相应的受体〔6〕。

生长调节素或INS样生长因子(IGFs)由生长激素刺激生产和释放，它通过自分泌或旁分泌机制促进局部细胞增殖。鼠胰岛可释放IGFⅠ和IGFⅡ，外源性IGFⅠ和IGFⅡ的加入促进胰岛细胞再生，另外用IGFⅠ抗体可抵消部分生长激素(GH)，促进增殖作用。这些研究表明，IGFs中介了GH促生长作用，INS可与Ⅰ型IGF受体作用促进胰岛再生。

血小板衍生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)对某些细胞的作用，可称为“支配”因子，因它们本身并不进入细胞循环，而是通过其后的“执行”因子，如INS、IGFs或表皮生长因子(EGF)使细胞再生。

4.3激素的调节已知生长素(GH)对β细胞再生和INS的合成有促进作用，与此密切相关的催乳素和胎盘催乳素也促进再生，鼠β细胞有催乳素受体，在许多组织GH是通过刺激IGFs的产生和释放而起到促进细胞增殖效应的〔7〕。

胃肠(GI)肽类激素除调节消化器官本身的活动外，还具有促激素和促生长等生理机能。GI肽类中的胃泌素、缩胆囊素、促胰液素和抑胃肽均刺激INS释放。有报道促胰液素和缩胆囊素可促进胰岛素细胞再生，但此方面的研究较少，需进一步证实。

类固醇激素对胰岛作用的研究，体内与体外的实验结果不一致。体内给予糖皮质激素促进β细胞肥大、增殖、血中INS浓度升高；而体外实验为糖皮质激素抑制INS释放和细胞再生，也有报道不抑制，但未证实其促进作用。

4.4基因的调控为提高胰岛细胞再生能力，许多学者从基因调控方面进行了探索。大鼠经90%去胰岛术在数周内发生糖尿病，再用DNA修复酶多聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂尼克酰胺治疗可诱导胰岛细胞再生，减低糖尿病的发病率。已鉴定其作用是由一种仅在增生的胰岛表达，而正常胰岛不表达的特异再生基因(regeneratinggene,Reggene)所致〔8，9〕，由此生产的Reg蛋白参与β细胞的再生增殖〔10〕。人类Reg基因也已鉴定，其结构同大鼠的相似。另外正常的胰腺泡细胞也可产生Reg蛋白，以前由人体胰石和胰液分离的胰石蛋白(Pancreaticstoneprotein,PSP)以及由人胰腺分离出的胰线蛋白(Pancreaticthreadprotein，PTP)均为由Reg基因产生的同一种蛋白〔11，12〕。Reg蛋白的作用可以看作为胰岛β细胞的自分泌型生长因子，最近有人观察到用不同营养因素和激素作用培养的大鼠胰岛细胞，可见β细胞的增殖与Reg基因的表达有相关性〔13〕。用Reg蛋白治疗90%去胰岛大鼠，β细胞增加，血糖显著降低〔14〕。另外Reg蛋白促进离体β细胞核中3H-TdR的掺入增多。这些结果表明，Reg蛋白有望开辟治疗糖尿病的一种新途径。

另外许多其它因子，如cAMP、胰岛素原、糊精、热休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)和超氧化物歧化酶均有报道与胰岛的修复相关〔3〕。

参考文献

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细胞研究篇3

1资料与方法

1．1方法

1．1．1分离培养hBMSCs在志愿者髂前上棘抽取骨髓10mL。采集的骨髓用生理盐水1∶1稀释，密度为1．077g／L的淋巴细胞分离液2000r／min离心15min，收集白膜层，生理盐水漂洗2次。以含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以一定密度接种于75mL培养瓶中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱内培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每2～3d换液1次，待细胞达80％融合时，用0．25％胰酶＋0．02％ED－TA消化，以1∶3的比例传代培养。

1．1．2流式检测hBMSCs表型hBMSCs用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化，1000r／min离心5min，生理盐水洗涤，制备成1×106／mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人CD34、CD29、CD105抗体，设置空白对照，避光冰育30min，生理盐水洗涤3次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1．1．3鉴定hBMSCs多向分化潜能以4×103／cm2密度将第3代hBMSCs接种于6孔板，每孔2mL。（1）成脂诱导及鉴定：细胞达到完全融合后4d，实验组加入脂肪诱导液（H－DMEM，10％FCS，0．5mmol／LIBMX，10μg／mL牛胰岛素，0．2mmol／Lindomethacin，1μmol／L地塞米松）诱导3d，再用脂肪保持液（H－DMEM，10μg／mL牛胰岛素，10％FCS）处理1d，循环3次，再用脂肪保持液处理2d。对照组加入含10％FCS的H－DMEM，每3天换液1次。2周后油红O染色鉴定。（2）成骨诱导及鉴定：细胞达到60％～70％融合后，实验组加入成骨细胞诱导液（OS，含1×10－7mol／L地塞米松，10mmol／L甘油磷酸钠，50g／mL维生素C），对照组加入L－DMEM完全培养液，置培养箱中，每2天换液1次，第21天终止诱导。茜素红S染色鉴定。

1．1．4分组处理hBMSCs采用0．25％胰酶＋0．02％EDTA消化hBMSCs，用不同输注液制备单细胞悬液。根据输注液不同分为生理盐水组（9g／L氯化钠注射液）、糖盐组（50g／L葡萄糖氯化钠注射液）、清蛋白组（含5％人血清蛋白的氯化钠注射液）。分别在4℃和25℃温度条件下置于不同时间点（0．5、1．0、2．0、4．0，6．0h）后进行以下检测。（1）取90μL细胞悬液与10μL胎盘蓝混匀，3min内计数活细胞（未染色）和死细胞（染色），测定细胞存活率。（2）另取1×106／mL细胞行流式细胞术检测细胞表型CD34、CD29、CD105。（3）再将不同分组细胞悬液，1000r／min离心5min，采用含10％FBS的L－DMEM作为完全培养液，以1×103／mL密度接种于96孔板，每组设3个复孔，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养7d。采用CCK－8在酶联免疫检测仪上测定450nm各孔波长吸光度（A）值，以时间为横轴，A值为纵轴绘制生长曲线。

1．2统计学处理采用SPSS17．0进行数据分析，结果用x±s表示。采用t检验进行两组均数间比较，采用单因素方差分析进行多组均数间比较，采用LSD最小显著差数法进行均数间两两比较。P＜0．05表示差别有统计学意义。

2结果

2．1hBMSCs形态观察原代hBMSCs贴壁后，呈圆形，散在分布。3d后完全换液，去除未贴壁细胞，可见少量分散短梭形贴壁细胞。第14天时，贴壁细胞融合成单层，细胞排列有明显方向性，呈漩涡状。见图。

2．2hBMSCs的表型流式检测第3代hBMSCs的表型发现，CD105阳性率98．7％，CD29阳性率97．7％，表达率极高；CD34阳性率为2．9％，表达呈阴性。

2．3hBMSCs分化能力鉴定hBMSCs成脂诱导2周后，光学显微镜下可见大量融合成串珠状的圆形脂滴。油红O染色可见被染成橙红色的脂滴，显示分离的hBMSCs可被诱导向脂肪细胞分化。成骨诱导3周，细胞逐渐融合，失去细胞结构，14d左右出现明显钙结节，茜素红S染色后可见散在大量橘红色钙结节，显示培养的hBMSCs可被诱导向成骨细胞分化。

2．4hBMSCs存活率检测在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对保存在25℃、4℃的3个实验组的细胞存活率检测，结果见表1～2。结果显示，糖盐组细胞存活率最低，25℃保存4．0h时只有约10％细胞存活；而清蛋白组细胞存活率最高，25℃保存2．0h时清蛋白组细胞存活率仍可达90％，差异有统计学意义（P＜0．05）。25℃和4℃条件下，保存0．5h时，生理盐水组及清蛋白组细胞存活率都超过90％，随着保存时间延长，各组细胞存活率逐渐下降。

2．5不同分组细胞表型检测25℃和4℃条件下，在5个时间点（0．5、1．0、2．0、4．0、6．0h）对3个实验组的细胞表型检测，结果见表3～5。结果表明，不同输注液、保存温度及保存时间对细胞表型影响差异无统计学意义（P＞0．05）。

2．6细胞生长曲线测定将不同分组处理后的细胞，采用L－DMEM完全培养液重新接种培养，检测细胞增殖能力，结果见图2（见《国际检验医学杂志》网站“论文附件”）。50g／L葡萄糖氯化钠注射液组保存的细胞增殖能力最差，保存4h后细胞失去贴壁和生长能力（无细胞贴壁无法完成生长曲线）。5％人血清清蛋白氯化钠注射液组细胞增殖能力比9g／L氯化钠注射液组细胞增殖能力强。同一组细胞4℃条件下不同时间点的增殖能力比25℃条件下强。随着保存时间延长，各组细胞增殖能力逐渐下降。

3讨论

hBMSCs是来源于骨髓的间质干细胞，不仅能分化成肝细胞、胆管上皮细胞［4］、血管内皮细胞［5］、不同类型的皮肤细胞［6］、神经样［7］细胞，还具有免疫调节、炎症趋化等特性，使其在肝脏疾病、血管外科、烧伤整形外科及神经损伤等疾病治疗中发挥越来越重要的作用。干细胞注射液从实验室制备到运送至病房回输给患者具有一定时空距离，特别是随着异地移植病例的增多，如何有效地保存干细胞注射液，对于细胞移植的临床应用非常重要。目前相关研究更多集中于将干细胞冷冻于－80℃或液氮等进行长期保存的探讨［8－9］，有关短时保存条件对干细胞生存和生长影响的研究不多。本实验探讨了几种临床常用注射液在不同温度下短时保存干细胞对细胞存活和增殖能力等状况的影响。形态学观察显示，培养的细胞呈均一长梭形，辐射状生长；流式细胞术检测细胞表型显示CD34表达阴性，CD29、CD105表达阳性；成脂诱导后出现大量脂滴，成骨诱导后出现钙结节，表明该细胞确为hBMSCs。

细胞研究篇4

1DPSCs的发现和生物学特性

牙髓是结缔组织,位于牙齿髓室和根管内，有一定修复再生的能力。由于成牙本质细胞是一种终末细胞,一旦分化后就不再分裂，因此普遍认为在成牙本质细胞遭受损伤后，牙髓内存在的未分化前体细胞可分化为成牙本质细胞，并分泌细胞基质。但直到2000年，Gronthos等[1]才首次正式提出DPSCs的概念,把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓细胞命名为DPSCs，在试验中应用酶消化法对成人第三磨牙牙髓细胞进行体外培养，并与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)进行比较,结果表明,这两种细胞具有相似的免疫表型，但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生率,经体外诱导后能形成分散而高密度的钙化小结，当将DPSCs与HA/TCP支架共同培养后回植到小鼠背侧皮下，能观察到类似牙本-牙髓复合体样的结构。Miura等[2]发现人脱落乳牙(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED)的牙髓中含有多能干细胞,具有高度增殖和克隆形成的特性，当将体外扩增的DPSCs和SHED与羟磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalciumphosphate,HA/TCP)联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质-牙髓样结构。Young等[3]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20～30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实了在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。

DPSCs在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形成单位（colonyformingunitfibroblast,CFU-F）[1]，大多数细胞呈长梭形，体积较小。透射电镜下，DPSCs的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%～90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。胞浆很少，核浆比例大。细胞器较少，核糖体丰富,这些形态特征也体现了DPSCs的未分化或低分化状态。自我更新是干细胞的重要特性，Gronthos等[4]从3个月的原代DPSCs移植物中分离出基质样细胞,在体外培养扩增后植于小鼠皮下,结果形成牙本质-牙髓复合体样结构。对形成的牙本质样结构进行免疫组化检测,发现其牙本质涎蛋白(dentinsialoprotein,DSP)表达阳性,证实DPSCs具有自我更新能力。多向分化能力也是干细胞的特征之一，在不同的微环境下，DPSCs可分化为多种细胞，矿化诱导培养基中，DPSCs能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）[5]；在脂肪诱导培养基中，DPSCs培养物中出现油红“O”阳性的脂滴，并伴随脂肪细胞特异性的pparγ2和lpl基因表达上调；此外，DPSCs还在mRNA和蛋白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志：神经巢蛋白（nestin）和神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidprotein，GFAP），这说明体外培养的DPSCs有向神经样细胞分化的潜能[5]。其他学者也成功地诱导了DPSCs向成牙本质细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化[6-7]。

2DPSCs的定位、分离和鉴定

Gronthos等[1]推测DPSCs可能来源于血管周围的微环境(perivascularniche)。Shi等[8]研究发现，DPSCs和BMSCs存在于它们起源组织的微血管周围。Tecles等[6]选取拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分为三组：一组制备累及牙本质的浅洞，一组制备暴露牙髓的深洞，一组不做处理，分别观察牙髓内干细胞的活化和迁移，结果表明血管周围存在干细胞。干细胞表面的分子标记是鉴定和研究干细胞功能的重要手段，目前发现明确的干细胞标记不多，对DPSCs的标记物研究也不够深入。Gronthos等[1]应用免疫组化技术研究DPSCs的表面分子标记，并与BMSCs比较。结果表明，均表达与内皮细胞(血管细胞粘附分子1、CD146)、平滑肌细胞(α2平滑肌肌动蛋白)、骨细胞(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨连接素、骨桥素、骨钙素)和成纤维细胞(Ⅲ型胶原、成纤维细胞生长因子2)有关的分子标记。DPSCs不表达骨基质蛋白、骨涎蛋白，而在BMSCs为低水平表达。用Northernblotting方法研究发现DPSCs不表达成牙本质细胞的特异性标记物牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)，说明DPSCs处于未分化状态,尚未分化为成熟的成牙本质细胞。为进一步比较DPSCs和BMSCs的性质，Shi等[7]应用基因芯片技术研究DPSCs和BMSCs的基因表达情况,发现两者在人类将近4400个基因表达水平上是一致的，包括表达细胞外基质成分、细胞粘附分子、生长因子、转录调节因子等的基因。但同时发现，DPSCs较高表达ⅩⅤⅢα1型胶原、胰岛素样生长因子2、盘状结构域酪氨酸激酶、NAD(P)H2维生素K3氧化还原酶、周期素依赖性蛋白激酶6等；BMSCs较高表达胰岛素样生长因子连接蛋白27和Ⅰα2型胶原。Liu等[9]研究发现,DPSCs分化时，初始Runx2、TGFβ相关基因、胶原代谢相关基因上调、碱性磷酸酶活性上升，后均下降；而细胞外基质磷糖蛋白(matrixextracellularphosphoglycoprotein,MEPE)是DPSCs分化过程中唯一下降的标记物，作者认为MEPE是矿化的抑制剂,在DPSCs分化时下调，可作为DPSCs分化时的检测指标。最近Mokry等[10]研究表明，牙髓干细胞表达STRO-1、vimentin、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞的细胞标志物，同时表达Sox2,nestin及nucleostemin干细胞标志物。

3DPSCs的多向分化能力与相关因素的调控

牙髓干细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能干细胞[11]，研究发现其细胞群主要是来源于神经嵴细胞群，细胞标志物为lowaffinitynervegrowthfactorreceptor(LANGFR)和间叶细胞群，标志物为1-integrinreceptorsubunit。这两个细胞群都具有多向分化的功能。牙髓干细胞的多项分化能力即可塑性(plasticity)在国内外的很多实验中得到验证。Yu等[12]认为牙髓干细胞的分化方向取决于局部的微环境，他们在试验中发现利用猪牙胚细胞条件培养基能诱导牙髓干细胞形成更加合理组织学结构的牙本质-牙髓复合体。Iohara等[13]研究发现，BMP2能够刺激牙髓细胞分化为表达牙本质涎磷蛋白DSPP的成牙本质细胞。Saito等[14]也发现,BMP2能促进牛和人单层培养和三维胶丸培养的牙髓细胞分化为成牙本质细胞。Keklikoglu等[15]认为转化因子AP21家族的成员FosB在成牙本质细胞和牙髓未分化间充质细胞的分化和增生方面有重要作用。Moioli等[16]的研究,TGF2β能诱导DPSCs向成牙本质细胞分化。Liu等[17]研究表明牙本质素是MEPE的一个肽片段,它能下调P16，促进DPSCs的增生，在牙髓修复中扮演重要角色。Gronthos等[1]发现DPSCs在含有L2抗坏血酸22磷酸、地塞米松、无机磷酸盐的矿化诱导液培养基中培养5～6周后,经染色表明有钙结节形成。Yamada等[18]的研究表明，人DPSCs高表达DMP1，而DMP1在未分化间充质细胞分化和牙本质矿化中起重要作用。Arthur等[19]体内和体外实验中，分别加入了各种生长因子如EGF及FGF等，均发现牙髓干细胞可以分化为具有功能活性的神经元。FrancescaPaino等[20]认为黑素细胞和牙髓细胞均源于神经嵴细胞群，在试验中DPSCs在没有外加定向诱导因素下，表达TRP-2、TRP-1、gp100/PmelandMART-1抗原，且能自主分化为完全成熟的黑素细胞。Demarco等[21]最近研究把三维多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室内，用晶体盐或胶体做成孔剂辅料，把牙髓干细胞接种于其内，发现与牙本质相关的形态发生因子在诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化中起着重要的作用，且DPSCs的微环境对细胞的行为和分化也有重要的影响。JingWANG等[22]用纳米纤维多聚乳酸支架进行DPSCs体内体外定向分化研究，发现BMP-7和DXM复合因子及纳米纤维多聚乳酸支架可大大提高DPSCs向牙髓牙本质复合体的定向分化能力。Gronthos等[23]实验成功对DPSCs进行了脂肪诱导，而Norsat等[24]证明DPSCs具有神经分化分化能力。

4DPSCs向iPSCs的重组转化

诱导多潜能性干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs）是通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子，以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于iPSCs既避免免疫排斥，又不涉及伦理道德问题，因此具有广泛且重要的临床应用价值。在2006年日本学者Takahashi和Yamanaka[25]研究小组采用体外基因转染技术,从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个转录因子,通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞,在小鼠ES细胞的培养条件下获得了Fbx15+的多潜能干细胞系,该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似,而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞,故将其命名为iPSCs，从那开始全世界众多实验室开始了iPSCs研究[26-28]，相继从狗、猪、猴和人等哺乳动物的皮肤细胞、肝细胞、羊水细胞、CD34血细胞、骨髓干细胞及牙齿干细胞等成体细胞成功获得了iPSCs。其中牙髓组织在临床上易于获得，不牵涉伦理问题而得到广泛关注。Tamaoki[29]和XingYAN等[30]研究小组利用病毒载体把c-Myc、Klf4、Oct4、Sox2和Lin28、Nanog、Oct4、Sox2因子导入牙髓干细胞中，成功获得了iPSCs。

迄今为止，关于DPSCs的研究，国内外学者做了大量的工作，取得了很大的进展。但是DPSCs的研究仍面临许多问题,如DPSCs有无特异性细胞标志物?DPSCs的鉴定标准?DSPCs的潜在分化能力和如何定向诱导DPSCs的分化?Telomere在DPSCs体外培养和体内增殖过程中的作用机制？DPSCs向iPSCs的成功转化载体和重组因子的优化？这些问题说明DPSCs应用于临床还有很长的路要走,需要相关学者更多的基础和临床研究。

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细胞研究篇5

诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPS）是通过基因转染技术(genetransfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。iPS细胞的研究受到人们广泛的关注，是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。iPS细胞技术诞生还不到2年，却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望，iPS细胞技术的出现使人们从ES细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是，目前制备iPS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题，因此探索一种高效、安全的iPS细胞的制备方法显得十分必要。

1iPS细胞的制备方法

2006年Takahashi等［1］研究小组利用分别携带Oct4、Sox2、Myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)，经过G418药物筛选成功获得第1批iPS细胞。但是这批iPS细胞系中DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞不同，而且这批iPS细胞不能形成畸胎瘤。Okita等［2］研究小组报道了第2批iPS细胞的产生。他们采用与制备首批iPS细胞相同的方法，但是采用了不同的筛选基因。第2批iPS细胞系DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞的甲基化方式相同，并且能形成畸胎瘤。2007年末，Takahashi和Yu等［3，4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于iPS研究里程碑的实验结果，他们都成功获得了人的iPS细胞系。Yamanaka采用与诱导小鼠iPS相同的方法，成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。Thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法，他们利用慢病毒载体运输Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子转染IMR90胚胎成纤维细胞，并且成功地获得了人iPS细胞。2008年1月Nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用Oct4、Sox2和Klf43种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出iPS细胞。Aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为iPS。Stadtfeld等［7］实验小组利用Oct4、Sox2、cmyc和Klf44种转录因子将胰岛细胞诱导为iPS细胞。

Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成iPS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备iPS细胞的方法，使用4种转录因子（Oct4、Sox2、cMyc和Klf4）及CCATT/增强子结合蛋白（C/EBPα），成功地将成熟B淋巴细胞诱导为iPS细胞。

Eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带Oct4、Klf4和cMyc3个转录因子将神经祖细胞诱导为iPS细胞，之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带Oct4和cMyc或Oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为iPS细胞。他们检测到在成人神经干细胞中Oct4和cMyc的表达量高于胚胎干细胞中Oct4和cMyc的表达量，因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为iPS细胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时，可以减少其他转录因子的使用。

当一系列人正常体细胞被诱导成iPS细胞之后，科学研究者开始研究患者的细胞是否也能诱导成iPS细胞。Dimos等［11］研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）患者的细胞成功诱导成为iPS细胞。随后Park等［12］报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、三型葡萄糖脑苷脂沉积症、帕金森综合征、舞蹈症、青少年I型糖尿病等患者的细胞诱导为iPS细胞。

体细胞可以诱导为iPS细胞，但是获得iPS细胞的几率很低。于是科学研究者们研究能否找到提高iPS细胞产生效率的方法。Mali等［13］报道他们将SV40大T抗原和Oct4、Sox2、cMyc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高iPS细胞产生的效率，而且iPS细胞提前1～2周产生。Huangfu等［14］报道DNA甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高iPS细胞产生的效率。Aasen等［15］研究小组报道采用逆转录病毒运输Oct4、Sox、Klf4和cmyc诱导人角化细胞产生iPS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生iPS细胞的效率至少提高100倍，而且大大缩短了产生iPS细胞的时间。

Maherali等［16］研究小组报道了制备iPS细胞新的研究平台，并指出可从分子、遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的iPS细胞诱导技术，采用doxycycline诱导转录因子的表达，从而可以通过药物来控制iPS细胞的产生，其制备的iPS细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现，不同的皮肤细胞类型用于诱导产生iPS细胞的时间也不同［16］。Huangfu等［17］研究小组报道仅利用反转录病毒表达Oct4和Sox2两种转录因子，同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物丙戊酸（ValproicAcid，VPA）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和NHDF逆转成iPS细胞。

最近，Stadtfeld等［18］报道他们利用腺病毒载体运输Oct4、Sox2、Klf4和cMyc4种转录因子成功获得无病毒整合的iPS(AdenoiPS)细胞。Okita等［19］研究小组采用2种质粒分别携带Oct4、Sox2和Klf43种转录因子和cmyc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为iPS细胞，经过检测并无质粒整合进入iPS细胞基因组中，即获得了在基因组水平无转录因子整合的iPS细胞。Frank等采用带有loxpCre系统的病毒载体诱导iPS，此系统可将整合到iPS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除，因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于Parkinson患者成纤维细胞的iPS;而Knut等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的iPS。这些无病毒基因组成分的iPS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。iPS细胞产生的方法归纳见表1。表1诱导iPS产生的方法

小鼠胚胎成纤维细胞［13］Oct4，Sox2，Klf4小鼠及人成纤维细胞［5］Oct4，Klf4，cmyc神经祖细胞［9］Oct4，Klf4成人神经干细胞［10］Oct4，cmyc成人神经干细胞［10］Oct4，Sox2，cmyc，Klf4，Nanog人角质细胞［16］Oct4，Sox2人成纤维细胞系BJandNHDF［17］

2iPS细胞的应用

iPS细胞技术是一把了解细胞核基因组重序(reprogramming)的钥匙，因为iPS细胞在功能上与胚胎干细胞几乎完全相同。因此，iPS细胞的诱导产生过程将是我们了解基因组重序分子机制和个体特异的疾病发生机制的最理想的模型。Hanna等［20］近期已经进行了iPS细胞应用基础研究的首次尝试，利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型，取其尾尖部皮肤的成纤维细胞，通过导入Oct4、Sox2、Klf4和cMyc基因，获得自体iPS细胞;进一步采用基因特异性打靶技术对人类镰状血红蛋白等位基因进行纠正后，将体外培养的自体iPS细胞诱导为造血干细胞，移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Dimos等［11］报道将ALS患者的体细胞诱导获得的iPS细胞成功定向分化为运动神经元，而ALS疾病的特征就是患者的运动神经元受到破坏。与此同时，Martin研究小组发表将Oct4、Sox2、Klf4和cMyc诱导得到的iPS细胞定向分化为有功能的心肌细胞的研究结果。

3iPS的安全性

iPS细胞技术的问世为生命科学的研究和人类疾病的治疗带来巨大的希望，随着研究的深入进行，多种终末分化细胞甚至是患者的细胞都能被诱导成iPS细胞，还有iPS细胞初步应用小鼠疾病模型治疗的成功，这一切似乎预示着iPS细胞距人类疾病的临床治疗不远了。但是，iPS在投入临床疾病治疗之前，必须考虑iPS细胞安全性的问题。目前制备iPS细胞的方法主要是利用逆转录病毒运输系统将几种转录因子导入体细胞，逆转录病毒在染色体上随机插入整合到体细胞基因组内并启动转录因子的表达。逆转录病毒的随机插入存在着潜在的风险，有的转录因子如cmyc和Klf4，它们本身就是一种原癌基因，导入cMyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%［2］。由于cMyc基因具有危险性，研究者投入无cMyc基因的iPS研究，但是经过研究发现这些无cMyc基因的iPS细胞依然具有致瘤性。

4展望

iPS细胞技术诞生还不到2年，但却受到极大的关注和广泛的研究，现已成为生命科学研究领域研究和探讨的焦点，为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望。人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域，iPS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破，多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞，并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态，表明细胞的巨大可塑性。但是，iPS细胞在应用于临床之前，还面临许多问题:①逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范;②需要深入研究比较iPS细胞和hES细胞在细胞生物学特性、定向分化机制等方面是否具有显著的差异;③需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险，如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式，或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入;④提高制备iPS细胞的效率。需指出的是，iPS细胞研究的突破并不意味着ES细胞研究的衰亡，因为iPS细胞所使用的转录因子正是来源于ES细胞长期研究的积累。

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细胞研究篇6

[摘要]目的探讨激活态雪旺细胞（SCs）对神经干细胞（NSCs）的分化作用。方法取出生24h内的SD乳鼠脊髓NSCs，分离培养并传至4代。取体重（100±5）g的SD大鼠，结扎右侧坐骨神经，1周后取双侧坐骨神经，左侧提取正常坐骨神经分离培养SCs（普通SCs），右侧提取结扎变性的坐骨神经分离培养SCs（激活态SCs），均采用双酶消化加差速贴壁法。将SCs与NSCs应用Transwell培养皿联合培养，分为三组：A组为激活态SCs与NSCs；B组为普通SCs与NSCs；C组仅为NSCs。于培养的第2、4、6天检测各组NSCs活性。1周后，Westernblot检测各组SCs表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平，免疫荧光检测各组NSCs分化比例。结果传至4代的NSCs生长稳定，分离的SCs7d后大量增殖呈旋涡状。联合培养后MTT法检测细胞活性，第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义（P>0.05），第6天C组活细胞比例开始降低，A、B组与C组比较差异有统计学意义（P<0.05），A组与B组比较差异无统计学意义（P>0.05）。Westernblot检测A组细胞表皮生长因子（EGF）表达水平（0.486±0.028）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达水平（0.385±0.023）均高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。MAP-2荧光染色，每高倍视野阳性细胞比例A组[（35.26±2.53）%]高于B组[（27.63±3.45）%]，差异有统计学意义（P<0.05）；GFAP荧光染色，每高倍视野阳性细胞比例A组[（62.42±3.78）%]低于B组[（70.18±1.26）%]，差异有统计学意义（P<0.05）。结论激活态SCs能够促进NSCs向神经元的分化进程，提高神经元的分化比例。

[关键词]雪旺细胞；神经干细胞；细胞分化；联合培养；神经元

[中图分类号]R741.02[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2014）03（a）-0019-04

EffectofactivatedSchwanncellsininducingdifferentiationofneuralstemcells

ZHANGRuiZHANGJunZHAOChengbin

DepartmentofOrthopedic，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，HeilongjiangProvince，Harbin150086，China

[Abstract]ObjectiveTodiscusstheeffectofactivatedSchwanncells（SCs）inthedifferentiationofneuralstemcells（NSCs）.MethodsThespinalcordofSDratwastakeninthe24hoursafterbirth.TheNSCsfromspinalcordwereseparatedandcultureduntilthefourthpassage.（100±5）gSDratwasusedtoligaturetherightsciaticnerve.Afteroneweek，boththerightandleftsciaticnervewereisolatedtocultureSCsbydoubleenzymesdigestionanddifferentialattachment.TheSCsfromtherightsciaticnervewerenamedactivatedSCs，andtheonesfromtheleftsidecalledcommonSCs.ThentheSCsandNSCswereco-culturebyTranswellculturedish，andtheyweredividedintogroupA，groupBandgroupC.groupAwasactivatedSCsandNSCs，groupBwascommonSCsandNSCs，andgroupCwasjustNSCsascontrol.Thecytoactivewasdetectedatthesecond，fourthandsixthdays.Oneweeklater，theEGFandbFGFsecretedbySCsweredetectedinWesternblot，andthedifferentiationratioofNSCswasdetectedbyimmunofluorescence.ResultsThefourthpassageNSCsgrewstably，andtheSCsproliferatedasvortexafter7days.Thedifferenceofcytoactivebetweenthesecondandfourthdaywasnotstatisticallysignificant（P>0.05）accordingtotheMTTdetection.However，thecytoactivebegantoreduceatthesixthdaybyMTTdetection，andthecytoactiveofgroupAandgroupBweresuperiorthanthoseofgroupC，thedifferenceswerestatisticallysignificant（P<0.05）.ThedifferenceofcytoactivebetweengroupAandgroupB，thedifferencewasnotstatisticallysignificant（P>0.05）.TheexpressionofEGFandbFGFingroupA[（0.486±0.028），（0.385±0.023）]werebothhigherthanthoseingroupB，thedifferenceswerestatisticallysignificant（P<0.05）.ThepositivecellsratioofeachhighpowerfieldofgroupA[（35.26±2.53）%]wassuperiorthanthatofgroupB[（27.63±3.45）%]accordingtotheMAP-2staining，thedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.ThepositivecellsratioofeachhighpowerfieldofgroupA[（62.42±3.78）%]waslowerthanthatofgroupB[（70.18±1.26）%]accordingtotheGFAPstaining，thedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.ConclusionTheactivatedSCscanpromotetheNSCsdifferentiateintoneurons，andimprovetheratioofneurons.

[Keywords]Schwanncell；Neuralstemcell；Celldifferentiation；Co-culture；Neuron

[基金项目]黑龙江省自然科学基金项目（编号D200901）；黑龙江省教育厅科技研究项目（编号11531160）。

[作者简介]张睿（1987.2-），男，哈尔滨医科大学2011级在读硕士研究生；研究方向：神经干细胞应用。

[通讯作者]赵承斌（1958.5-），男，主任医师，教授，硕士研究生导师；研究方向：脊柱外科。

周围神经损伤是骨科常见的疾病之一，虽然周围神经具有一定的再生能力，但对于较大缺损却很难自身修复[1]。随着组织工程学领域研究的深入，神经干细胞（NSCs）已被公认为是对神经损伤修复的有效方法，通过NSCs在神经断端的不断分化，使受损的周围神经重新恢复连接。然而单纯形态学得连接不能保证神经的传导功能，有研究表明，这与NSCs分化过程中分化为胶质细胞和神经元的比例有关[2]，提高神经元的分化比例，降低胶质细胞的表达可有效提高神经的传导速度，因此许多学者通过不同方法促进神经干细胞向神经元的分化[3-5]，均取得了一定进展。本研究通过激活态雪旺细胞（SCs）刺激NSCs的分化，观察其诱导NSCs分化为神经元的能力。

1材料与方法

1.1实验材料

雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032]；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；青-链双抗，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶（碧云天，中国）；兔抗鼠单克隆抗体Nestin，FITC标记的羊抗兔IgG，兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体，兔抗鼠MAP-2、GFAP单克隆抗体（武汉博士德公司）；Transwell培养皿（Corning公司，美国）。

1.2实验方法

1.2.1神经干细胞的分离培养与鉴定取出生24h内的SD大鼠，断髓处死后无菌条件下取出脊髓，显微镜下剥离硬脊膜，剪成5mm3组织块，加入0.25%胰酶消化10min，用吸管反复吹打至单细胞悬液，加入5mLDMEM/F12培养基终止消化。1000r/min离心5min，弃上清，加入含20ng/mL的EGF和20ng/mL的DMEM/F12培养液，重悬后移入细胞培养瓶，置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。每6～8天传代1次，连续传4代。取第4代神经球，移入含有多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内，24h后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，加入兔抗鼠Nestin（1∶100）单克隆抗体作为一抗，4℃过夜，加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔二抗，孵育30min，进行观察。

1.2.2雪旺细胞的分离培养取体重（100±5）g的SD大鼠，10%水合氯醛3mL/kg腹腔麻醉后，以右侧臀大肌为中心消毒，铺无菌孔巾，纵行做一长约1.5cm切口，分离暴露坐骨神经，于近端结扎，逐层缝合。1周后，处死大鼠，分离双侧坐骨神经，右侧坐骨神经由于结扎变性，SCs受刺激而发生激活，称激活态SCs；左侧为正常坐骨神经，提取的SCs称为普通SCs。双侧坐骨神经均剪成5mm小段，加入0.1%胰蛋白酶和0.25%的Ⅱ型胶原酶消化1h，反复吹打至单细胞悬液，加入5mLDMEM/F12培养基终止消化。采用差速贴壁法，使成纤维细胞贴壁，未贴壁细胞移入含20ng/mLEGF和20ng/mL的DMEM/F12培养液中行原代培养。

1.2.3细胞的分组与联合培养将细胞随机分为3组，A组为激活态SCs与NSCs联合培养，B组为普通SCs与NSCs联合培养，C组NSCs单独培养，作为对照。细胞的联合培养采用0.2μm的6孔Transwell培养皿，上室为SCs，下室为NSCs。培养基采用不含任何营养因子的DMEM/F12培养基。于培养的第2、4、6天分别对下室细胞行MTT染色，检测细胞活性。

1.2.4Westernblot检测激活态雪旺细胞营养因子的表达水平联合培养1周后，取A、B两组上室细胞，提取总蛋白，进行电泳、转膜、封闭，分别加入兔抗鼠EGF（1∶100）、bFGF（1∶200）单克隆抗体，4℃过夜，加入AP显色液显色。用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值，并进行统计学分析。

1.2.5神经干细胞分化的免疫荧光检测联合培养1周后，将多聚赖氨酸包被的盖玻片放入下室，24h后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定，分别加入兔抗鼠MAP-2（1∶200）、GFAP（1∶200）单克隆抗体作为一抗，4℃过夜，加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1∶200），室温孵育30min。在100倍荧光显微镜下随机选取6个不同视野，计数抗原阳性细胞数与全部细胞数，计算阳性细胞数在全部细胞中的比值，公式为：阳性细胞比值=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3统计学方法

采用统计软件SPSS18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1神经干细胞的分离培养与鉴定

NSCs在培养瓶内悬浮生长，呈圆形，核较大，折光性强。于培养第5天开始聚集成团，呈球样生长，第7天左右可见部分神经球出现贴壁，并发出短小突起。传4代后，NSCs形态稳定，未见异型性改变。荧光染色可见聚集成球的NSCs发出绿色荧光，可见因贴壁而发出的短促突起。

2.2激活态雪旺细胞的分离培养

结扎SD大鼠右侧坐骨神经后，大鼠出现右下肢跛行，1周后有足部有溃疡形成。分离双侧坐骨神经，可见结扎远端坐骨神经明显较对侧增粗。细胞经差速贴壁以后可见胞体较大的成纤维细胞得以去除，去除后细胞呈梭形，3d后，胞体增长，发出突起，至7d细胞大量增殖呈旋涡状排列，激活态SCs生长速度较普通SCs的生长速度快。

2.3各组神经干细胞的分化状态

A组NSCs在培养5d后即开始发出较长突起，出现贴壁细胞，细胞形态增长，细胞间借突起形成网状连接。B组细胞在8d后开始出现分化，但细胞发出的突起较A组短小。C组细胞仍呈球形生长，少见贴壁细胞。应用MTT法检测三组细胞的平均光密度值，可见第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义（P>0.05），第6天C组活细胞比例开始降低，A、B组与C组比较差异有统计学意义（P<0.05），A组与B组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

A为激活态SCs作用下的NSCs活性检测；B为普通SCs作用下的NSCs活性检测；C为单独培养的NSCs活性检测

图1MTT法对神经干细胞活性的检测

2.4激活态雪旺细胞营养因子的表达水平

A、B两组上室细胞提取的蛋白经电泳后，条带清晰，两组相同蛋白密度有差异，管家基因GAPDH作为内参，电泳条带亮度一致。应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值，根据公式：相对量=产物电泳条带密度/GAPDH×100%，计算各组蛋白量，可见A组细胞EGF、bFGF的表达水平均高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1雪旺细胞营养因子表达的平均光密度值（x±s）

注：EGF：表皮生长因子，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子

2.5神经干细胞分化的免疫荧光检测

对三组细胞分别进行MAP-2和GFAP染色，计算每高倍视野阳性细胞的比例。A组细胞MAP-2染色阳性率明显高于B、C组，差异有统计学意义（P<0.05）；B组MAP-2染色阳性率明显高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。A组GFAP阳性率明显低于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；C组GFAP阳性率明显低于A、B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2免疫荧光染色阳性细胞在分化细胞中的比例（%，x±s）

注：与A组比较，*P<0.05；与C组比较，P<0.05

3讨论

各种外伤或病变所致的周围神经损伤一直以来都是显微外科研究的重点内容。虽然周围神经具有自我修复能力，但是如果缺损大于10mm以上则很难使近端神经纤维长入[6]，从而造成永久性的功能丧失。为此有学者研制出干细胞结合导管支架的技术[7-10]，使得周围神经的断端得以重连，然而单纯的形态学重建却难以恢复神经的传导速度。有研究指出NSCs在体内主要分化为胶质细胞，而胶质细胞则会影响神经元的传导速度[11-12]，因此NSCs如何高效分化出神经元就成为研究关键。

周围神经损伤后，损伤远端轴突发生华勒变性，继而坏死溶解，周围的SCs此时会发生增殖，一方面吞噬溶解的轴突，另一方面分泌大量神经营养因子促进近端轴突的长入[13-14]。本研究利用雪旺细胞这一特点，于体外建立SCs，使其持续分泌多种神经营养因子，诱导NSCs的分化。有研究指出，NSCs的生长分化需要多种营养因子的协同作用[15-16]，尽管某一因子的浓度较低，但却是不可或缺的。体外添加营养因子则难以满足干细胞分化的要求[17-18]。本研究运用细胞联合培养的方式，通过细胞间的旁分泌作用，克服这一不足。同时，应用Transwell培养皿，借助聚碳酸酯膜的作用使细胞间不发生接触，排除了细胞间的相互干扰。

本研究的结果可以看出，与普通SCs相比，激活态SCs对NSCs的诱导作用存在时间短、神经元分化率高等优点。但是从MTT染色可以看出，由于各组只应用单纯DMEM/F12培养基培养，活细胞比例随时间呈下降趋势，说明单纯在体外依靠雪旺细胞分泌的营养因子难以满足NSCs的生长需求，从而解释了体内移植神经干细胞死亡率高的原因[19-20]。这就需要进一步探索能够保持体内高浓度营养因子的方法，从而维持NSCs的体内生长状态。

由于条件限制，本实验尚存在一些不足之处，对SCs分泌的因子只进行了较为重要的EGF和bFGF的检测，如果能检测出全部营养因子的表达水平，将有助于进一步的详细分析。

综述所述，激活态雪旺细胞能够促进神经干细胞向神经元的分化进程，提高神经元的分化比例。

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