分子生物学实验篇1

[关键词]分子生物学实验；教学；改革；实践

[中图分类号]R-05[文献标识码]C[文章编号]1674-4721（2012）07（c）-0175-01

现代分子生物学的迅猛发展，给生命科学带来日新月异的变化，而且这门以实验为主的前沿学科已经渗透到医学的各个领域。在知识经济的新形式下，努力把学生培养成具有现代意识、国际视野、创新能力和良好职业素质的医学人才是实验教学的重点[1]。临床医学七年制分子生物学实验课的目的，不仅验证理论知识，掌握基本实验技能，还应致力于学生动手、动脑能力，科研能力,创新能力等综合素质的培养。在实验过程中，培养学生对实验现象进行观察和对结果进行分析、比较、综合并做出科学的解释，是我们的最终目的。因此，如何提高实验课教学水平，把常规的科研方法以及新技术传授给学生，让学生系统掌握实验技能，提高科研素质，成了我们实验教学不断探索的内容[2]。近年来笔者在实验课中进行了一些尝试性改革，并取得了一定的成绩。

1改革实验内容，提高科研素质

1.1基本技能训练

针对七年制学生毕业授予硕士学位这一特点，为了使学生受到基本的技能训练，在实验课中，笔者改变以往由教师在实验课前，为学生准备好各种试剂及器材的做法，让学生自己动手计算实验中所需的药品的数量，仪器设备等，凡是实验中涉及的物品清洗、高压灭菌、菌种接种和保存以及试剂配制均由学生自己完成。这样不但培养了学生实验操作能力，而且还使学生懂得了实验中每一步骤的作用及注意事项。在实践中培养学生独立完成一些相关的实验准备，为以后的临床实践打下基础。

1.2综合能力的培养

科研过程是一个创新的过程，许多分子生物学技术的改进和完善就是科学工作者创新的结果。为了适应医学学科的发展，加大分子生物学实验课内容改革的力度，我们开设了综合性的实验内容：从人血中基因组DNA的提取开始，通过PCR技术扩增看家基因（γ－actin）片段，经琼脂糖凝胶电泳，回收特定的PCR产物，然后进行连接、转化、筛选、工程菌的接种培养，保存以及重组质粒的提取、酶切、鉴定。这一综合性实验，是以基因工程流程为主线，一环紧扣一环。学生通过这一实验过程，不但把理论知识和实验内容有机地结合起来，而且极大地调动了学生学习的积极性，使科研思维得到了锻炼，为培养学生的创新能力奠定了基础。另外在实验课上，还安排了分子生物学基本技术、PCR技术及引物设计、DNA测序等教学内容，并根据学生的掌握情况详略讲解，并采取多媒体等技术手段，使枯燥的实验理论变成了生动有趣直观的教学形式，激发了学生学习的主动性和热情。

2更新教学手段，激发学生的兴趣

随着科学技术的不断发展，借助电子技术的现代化教学设备，利用大型仪器，多媒体技术和计算机进行辅教学，是当今教学改革的发展趋势。为此，我们对分子生物学实验教学手段进行了大胆的改革，根据教学内容改革的需要，把学生每次实验结果的观察，由原来的紫外透射仪，改为使用凝胶成像系统进行图像处理及结果分析，使学生能够形象、直观地在屏幕上看到每组的实验结果，并进行对比，同时向学生展示标准的结果，通过分析、对比发现自己在实验过程中的许多不足，从而激发学生对实验的极大兴趣和爱好，培养从事科学研究的动手和动脑能力，同时也培养学生的创造力和分析解决问题的能力，提高学生的综合素质[3]。

3改革考核方法，提高综合素质

为了全面提高和培养学生的科研能力，收集处理信息能力，总结分析、获取知识能力，语言文字表达能力以及解决实际问题能力，我们改变了传统的实验报告书写模式（目的、原理、步骤、结果分析等），全部实验结束后以科研论文的形式提交实验报告，而且要求学生在实验报告的最后，提出对此次实验内容安排有什么建议和意见，并用所学过的实验原理设计一个相关的实验内容。这一举措，充分调动了学生学习的积极性和主动性，培养和开拓了学生的科研思维，使学生的科研能力明显提高。实验成绩为100分，包括实验过程操作记录30分，科技论文50分，平时操作10分，课堂表现10分。

总之，通过医学分子生物学实验教学的改革，学生对分子生物学产生了浓厚的兴趣，参与实验的自觉性和积极性得到了很大提高[4-6]，不仅掌握了分子生物学的基本理论与实验技能，而且也提高了学生动手动脑能力，在实验中培养了学生的综合素质，增强了创新意识。

[参考文献]

[1]王晓霞，解军，张悦红，等.研究生分子生物学实验教学改革探讨[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，2010，12（11）：1091-1092.

[2]姚娟，隋建峰.基础医学综合实验与实验设计考核模式的探讨[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，2010，12（5）：519-520.

[3]易发平，卜友泉，马永平，等.医学分子生物学教学模式转变的实践[J].基础医学教育，2011，13（7）：623-625.

[4]李美宁，张悦红，常冰梅，等.医学七年制生物化学与分子生物学实验教学探索[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，2009，11（3）：301-303.

[5]刘友勋，黄娟.《分子生物学》课程实验教学改革的探索[J].读写算（教师版）：素质教育论坛，2011，（7）：114-115.

分子生物学实验篇2

我国生物化学和分子生物学的教学现状主要表现在教学课时不足,由于教学时间紧张,导致很多重要的生物实验都无法进行。在我国很多高校的生物化学和分子生物学的课程中,理论教学占了总课程量的很大比重。即使有些课程开设了实验教学内容,可是这些实验课也过多地依赖理论课。具体的表现就是生物化学实验、分子生物学实验的检测成绩占学生总成绩的比重太小,实验检测成绩仅仅只占学生20%的总成绩。这样的一种教学现状,必将导致学生重理论轻实践,导致学生的综合实践能力、创新能力大大降低。另外,传统的教学模式中,教师往往缺乏创新教学意识,无法把大量理论知识形象地传授给学生。缺乏创新的理论教学会逐渐变成一种灌输式教育,学生往往只能对生物化学和分子生物学知识死记硬背。这种学习效果不但起不到基本的理解作用,更无法把理论知识运用试验中去。

2我国生物化学与分子生物学教学改革的具体方法

2.1通过改变教学模式来激发学生的创新能力

生物化学和分子生物学是研究生命奥秘的一种科学,因此这些课程具有很强的实践性。学生如果仅仅只在课堂上进行理论学习,那就很难透彻地把知识学懂、学透。教师应该注重培养学生的实验能力,要鼓励学生自己去思考,让学生在探索中解决问题。教师要改变传统教学模式中的灌输式教育,要培养学生良好的实验能力。要在实验设计、实验内容、试验步骤等几个方面来强化学生的综合实践能力,尽量确保学生能够独立进行实验[1]。通过进行各种实验,要让学生学会用实验来验证问题。对于传统教学中学生难以理解的一些内容,教师可以改变教学模式,把过去讲解式的教学改变为实验式教学。比如关于蛋白质的分离纯化问题,教师可以鼓励学生自己去设计实验,让学生利用简单的实验设备来完成蛋白质的分离纯化。这样可以加深学生对知识的理解,同时还能有效地锻炼学生的实际操作能力。教师可以把理论知识变为不同种类的实验,让学生在进行各种独立实验的过程中锻炼他们的创新能力。

2.2通过独立的实验教学来强化学生的操作能力

目前很多高校的生物化学和分子生物学的教学课时比较少,比如生物化学的课时为30课时,而分子生物学仅为10课时。如何能够在如此紧张的教学时间中进行高效的实验教学？对于广大教师学生来讲,这是一个很严峻的问题。如果把生物化学和分子生物学进行合并,形成生物化学与分子生物学这样一个新的学科,这样就可以大大优化教学结构。同时对原先教材中的实验内容保留独立教学,从而让学生能用更多时间来进行实验。通过进行上述整合,可以增加验证性试验、综合性试验、设计性试验的数目。这些内容包括:哺乳动物基因组DNA的提取、PCR基因扩增、琼脂糖凝胶电泳检测DNA、酪蛋白的制备、老鼠心肌LDH的活力测定、质粒DNA的提取等。

2.3编写新的教学教材以适应新的教学模式

鉴于我国高校学生重理论轻实践的学习现状,我们应该在生物化学与分子生物学教学中多开展创新教学。我们应该着重培养学生的综合能力、创新能力,为了达到这一目标,我们可以编写新的教材。在新的生物化学与分子生物学教材中,主要有四大类实验教学内容,分别是光度法和离心法技术实验、电泳技术实验、DNA重组技术实验和生物大分子制备实验。新教材的编写注重学生综合实践能力的提升,因此加入了大量的实验内容。比如用光度法和离心法技术来验证血糖、蛋白质的含量,能够加深学生对知识的理解。学生在掌握光度法和离心法的实验技术之后,就可以使用这些技术来进行酶活性的验证实验;而一些综合性较强的实验,比如血清蛋白质和DNA的电泳分离实验可以锻炼学生的操作能力,让学生把课堂理论知识更好地运用到实践中来;学生通过对PCR基因进行扩增,对质粒DNA进行提取和酶切,可以掌握DNA重组和基因工程的基本操作技术;而在生物大分子的制备实验中,学生通过根据自己设计的实验方法来提取和分离DNA,使自己的操作能力和创新能力得以提高。

2.4通过多媒体教学来提升实验教学的效果

多媒体教学不仅能够激发学生的学习兴趣,而且还能够大大改善实验教学的方式。有时候,教师很难把一些实验内容清楚地讲给学生,可是教师一旦使用了多媒体教学,就可以让学生在观看多媒体教学动画的过程中学习。教师可以把一些实验课程制作成课件,让学生观看这些教学视频,从而能达到很好的教学效果。同时,多媒体教学还可以大大节省教师的备课时间,能够把教师从课堂教学中解放出来,让教师能够有更多时间去帮助学生解决实验中的困难。利用多媒体来进行实验教学,能够大大提高教学的效率,让学生的学习兴趣更加浓厚。

2.5通过优化教学结构来激发学生热情

在很长一段时间里,生物化学和分子生物学的教学内容比较少,很多教师对这些课程较少的课时很不满意。现在为了能够让学生更好地学习生物化学和分子生物学,我们可以适当地增加这些课的教学时间,通过增加课时的办法可以让学生能够更充分地学好知识。另外,对于理论教学在生物化学和分子生物学中占较多比例的缺陷,我们在教学改革的过程中应该适量地减少理论教学的内容,多增加一些具有实践性的教学内容。而在学生的成绩考核项目中,也应该把理论考试成绩所占的分数比重降下来,通过适当提高实验考试成绩在总成绩中所占的比重,能够让学生对理论实践产生重视。通过这样优化教学结构,可以大大增加学生的实践操作能力,能让学生的学习积极性得到很大的提高。

3生物化学和分子生物学教学改革所取得的成果

3.1通过改变教学方式从而优化了教学内容

传统的生物化学与分子生物学教学方式中存在着很多不合理的地方,主要表现在重视理论知识的教育而轻视实践操作教育。但是对生物化学与分子生物学进行教学改革之后,以前不合理的教学结构就发生了变化,综合实践类课程的比重由之前的30%提升到了70%,大大强化了学生实际操作能力。同时通过将生物化学与分子生物学进行合并,从而诞生了一门新的课程——生物化学与分子生物学,这样做能够精简过多的理论教学内容,而把实验性教学内容独立出来,使学生能有更充分的时间来进行实验学习。而多媒体教学在实验教学中的应用,不仅能够让学生更清楚地学习到实验中具体内容和操作步骤,而且能激发学生学习生物化学与分子生物学的强烈兴趣。

3.2通过教学改革可以有效提升我国生物化学与分子生物学的科研水平

科研的根本在于教育,只有对传统的教学模式进行改革,才能探索出一条适合我国生物化学与分子生物学发展的道路。正确合理的教学模式,必将促进我国生物化学与分子生物学又好又快地发展。通过教学改革可以建立起很多具有开放性、实践性的实验室,这些实验室能够为学生更好地服务。学生可以在这些实验室中自由设计实验内容,然后在实验室中选取合适的实验材料、药品仪器,并且在实验主导老师的指导下,进行正确的实验,以此来验证某些理论知识。生物化学与分子生物学教学改革不仅能够优化教学结构,还可以培养出一大批具备较高专业素养的生物科研人才。同时,教学改革还要对某些科研项目进行论证,科学的论证过程中必将提升我国生物化学与分子生物学的科研水平。生物化学与分子生物学的教学改革能够锻炼学生的实际操作能力,有效地调动起学生学习的积极性和主动性。同时教学改革注重实验教学的特点,有利于培养学生严谨钻研、实事求是的工作态度,对学生以后走上社会有很好的帮助作用。

4结语

分子生物学实验篇3

［关键词］分子生物学实验迁移理论教学应用

［中图分类号］G64［文献标识码］A［文章编号］1009-5349（2012）07－0214－01

在心理学中，所谓迁移是指一种学习对另一种学习的影响。它是学习者运用已有认知结构，在对新课题进行分析、概括的基础上实现的。其实质是一种揭示新、旧课题共同本质的过程。迁移有顺向和逆向两种，前学习课题对后学习课题的影响称为顺向迁移，反之，则为逆向迁移。不论顺向迁移还是逆向迁移，都有正负之分。凡一种学习对另一种学习起促进作用的称正迁移，反之，则为负迁移。迁移理论在教学中应用的案例和研究非常广泛，同样也存在于分子生物学实验教学中，分子生物学理论知识抽象，而实验技术又更新迅速，是学生学习压力比较大的一门课程。

一、正迁移引发学生学习兴趣

分子生物学的理论知识很抽象，学生学习时容易感到枯燥，通过实验教学形象直观，且将理论知识融入到具体的实验操作中，学生学习兴趣提高了，学习的主动性增强，主动的理论知识迁移到实践操作中，提高了学生学习的效果。

二、逆向迁移巩固理论知识

实验动手操作而得到的结果能让学生印象深刻，由实践向理论的逆向迁移，可巩固理论知识的学习。例如在植物基因组DNA提取实验中，通过实验，最终得到了白色絮状沉淀，即DNA沉淀，通过凝胶电泳检测DNA的纯度与亮度，检测的图片显示出点样孔发亮，那是蛋白质存在引起的，在DNA条带下方有圆球状的亮点，那是RNA在凝胶中的显示。这是再逆向回顾DNA、RNA和蛋白质的结构特性，完成了由实验向理论的逆向迁移过程，从而巩固了理论知识的学习。

三、运用类比、归纳培养迁移能力

学生迁移能力的培养需要掌握多种思维方式，其中类比、归纳是常用的方式，通过归纳、对比的教学方法提高知识迁移效果。分子生物学实验技术发展迅速，学生在实际科研工作中可将已学的基础实验通过类比的方式加以操作。同时对于实验中所涉及的细节加以归纳，形成完整的知识网络，才能做到“举一反三”“以不变应万变”。例如在DNA提取实验中，就有CTAB法和SDS法等多种方法，提取部位也可以多样，在教学中以CTAB法提取植物新鲜叶片向学生讲授，在实践中学生可以通过类比的方法进行模仿，同时通过归纳得出DNA提取的总体步骤为破解－分离-沉淀，这样学生就可以通过类比、归纳的方式完成知识和技术的迁移。

四、创造良好心态促进知识迁移

迁移的成功与否，与学习知识的情境有关，教学实践证明，学生的准备状态可以促使迁移的产生，也可以造成迁移障碍。[1]分子生物学实验步骤繁琐，实验周期长，实验药品毒害大，学生对这样的实验会有惧怕心理，得不到实验结果也会有挫败感，产生的负迁移是我们在教学中应尽量避免的。通过实验可以将微观的想象现实化，这样的结果让学生感到很神奇。对实验的安全操作加以强调，消除学生的顾虑，创造良好的心态。

五、利用网络资源扩展知识迁移

网络资源在教学中的应用广泛。[2][3]在实验教学中，可通过网络资源提供的海量的信息扩展学生的知识面，了解最新的技术进展。通过视频的播放，学习更多的实验技术，以拓展知识迁移的宽度和广度。

总之，迁移理论在分子生物学实验教学中有着重要的作用，其关键在于教师有效地引导思维正迁移的产生，促使学生开展多种思维模式，利用多种教学资源，有意识地培养学生动手操作的实践能力，帮助学生选择有效的正迁移，同时尽量避免负迁移的发生。

【参考文献】

[1]倪鸣春.迁移理论在高中数学教学中的应用[J].数学学习与研究:教研版,2011(5).

分子生物学实验篇4

Abstract：PlantgenomicDNAextractionisthemostbasicmolecularbiologyexperimentforundergraduatestudentsinagriculturalcolleges，butthisexperimenthassomequestionssuchascomplicatedprocedures，time-consumingandfrostbiteresultingfromliquidnitrogencausedbytheimproperoperationofstudents，whichcanbeavoidedafterimprovementsinordertoensurethesecurityandthesmoothgoingintheexperiment.

关键词：分子生物学；DNA提取；改进

Keywords：molecularbiology；DNAextraction；improvements

中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1006-4311（2015）35-0165-02

0引言

分子生物学实验是农业院校中为农学、园艺、植保和生物工程等专业开设的一门重要的专业基础实验课，旨在提高学生的实验技能和培养学生的科研素养。DNA是遗传信息的载体，是重要遗传物质。快速提取高质量的DNA样品是进行PCR扩增、限制性酶切、Southern杂交、测序等分子生物学实验的保障[1]。因此，“植物基因组DNA提取”实验是分子生物学实验中最基础、最常用的一个实验。选择合适的方法快速提取植物基因组DNA显得极为重要。

该实验采用液氮研磨植物叶片，裂解植物细胞，再利用有机溶剂多次抽提，使蛋白质等沉淀于有机溶剂中，使核酸保留在水相[2]。实验需要配制大量的提取液，而且步骤繁杂，学生常常顾此失彼，不能在规定时间内完成实验。此外，在用液氮研磨植物叶片过程中，学生们常常会因为好奇或操作不小心造成液氮冻伤情况。鉴于此，笔者对该实验操作步骤做了些适当的调整与改进，化繁为简，缩短了实验所需时间，提取的DNA质量完全能满足后续分子生物学实验的要求，而且避免了液氮对学生们引起的冻伤；同时，在实践中总结出学生实验操作中的注意事项，减少了学生实验出错的几率，提高了学生实验教学效果。现将结果报告如下。

1实验的基本原理

植物DNA提取方法有很多，常用的方法有CTAB法、SDS法、UREA法等，这些DNA提取方法在原理上基本一致，都是用液氮研磨植物幼叶破碎细胞，利用CTAB或SDS、UREA和β-巯基乙醇蛋白变性剂，再经加热使蛋白变性与DNA分离，在此基础上EDTA鳌合金属二价离子、氯仿的抽提使DNase对DNA的作用降到最低，经离心获得含有DNA的上清液，再用乙醇沉淀，得到生物基因组DNA。

2实验材料、试剂和仪器

①材料：用常规方法培育的大豆植株的叶片。②试剂：CTAB、乙丙醇、无水乙醇，苯酚：氯仿，TEBuffer：异戊醇（25：24：1），氯仿。③仪器：高速离心机、恒温振荡器，恒温水浴锅。

3原实验步骤

用液氮对大豆叶片进行充分研磨，取0.2g分装到2.0mL离心管中。在离心管中加入750uL预热的CTAB提取缓冲液，用涡旋混合器充分振荡混匀，放置在65℃水浴锅中温浴30分钟。冷却4-5分钟，加入750uL苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1）混合，放置水平摇床混匀20分钟，12000rpm/min离心10min。取上清液于1.5mL离心管中，加入等体积氯仿，水平摇床混匀5min，12000rpm/min离心10min。取上清，加入120uL异丙醇，12000rpm/min离心5min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TEBuffer溶解。

4改进后实验步骤

取大豆幼嫩叶片，用剪刀剪碎放入0.5ml离心管中。加200uLTPS提取液，用涡旋混合器充分振荡混匀，95℃加热10min，4000rpm/min离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇混匀，12000rpm/min离心3min。弃上清，用乙醇洗涤、烘干后，用TEBuffer溶解。

5效果评价

改进前，要用CTAB提取液、苯酚：氯仿：异丙醇（25：24：1）、氯仿反复抽提3次；改进后只用TPS提取液抽提1次。因此，改进后的实验既简化了实验步骤，又缩短了实验时间，而且通过改进后的方法提取的基因组DNA质量和数量完全能满足后续分子生物学实验的要求[3]。改进前，用液氮研磨植物叶片；改进后，用剪刀将植物叶片剪碎即可，虽然提取量会有所下降，但避免了因学生操作不当引起的液氮冻伤。

6实验中的注意事项

①要尽可能剪碎植物叶片。用剪刀将植物叶片剪成细小部分，剪得越细，提取的DNA的量会越多。

②要充分涡旋混合样品与提取液。因为此时DNA还没有分离，涡旋混合不会破坏DNA。充分涡旋使样品与提取液混匀，不要有结块儿现象，可提高DNA的提取量。

③操作要迅速、准确。剪切样品速度要快，转移样品要完全，以避免样品损失减少DNA的提取量。

7结论

通过分子生物学实验方法的改进，不仅提高了学生的实验技能和科研素养，还有效的缩短了实验时间、减少了学生实验出错的几率，确保了实验的安全、顺利进行，提高了教学效果。由于分子生物学技术的持续革新和教学模式的不断发展，分子生物学实验教学方法的改进成为了一项长期而艰巨的任务，教师仍要根据时代的发展和学校的特色，积极探索并完善适合本校的分子生物学实验的建设。

参考文献：

[1]詹少华，尹艺林.大豆基因组DNA提取纯化方法研究[J].安徽农业科学，2008，36（23）：9871-9872.

分子生物学实验篇5

【摘要】目的：探讨山莨菪碱（6542）对家兔创伤性急性肺损伤（ali）治疗作用的分子生物学机制.方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（cg），肺损伤组（ig）和治疗组（eg），每组24只.各组动物分别于肺损伤模型建立后1,2,3,4h各放血处死6只，留取支气管肺泡灌洗液（balf），分离肺泡巨噬细胞（pam），用凝胶电泳迁移率改变分析法（emsa）和rtpcr法检测pam中nfκb的活性变化及tnfαmrna的表达水平，用elisa法检测balf上清中tnfα和il8的含量.结果：ignfκb活性、tnfαmrna表达及tnfα,il8含量于模型建立后1~4h内均明显高于cg（p<0.01）；eg经山莨菪碱治疗后上述指标与ig相比均有明显下降（p<0.01,p<0.05）.结论：山莨菪碱对ali有治疗作用，此作用与其对nfκb活性及tnfαmrna,tnfα,il8表达抑制有关.

【关键词】山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子κb；细胞因子

0引言

tnfα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acutelunginjury,ali）的发生、发展中起重要作用［1］.nfκb是一种基因转录调节蛋白，通过调控tnfα和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］.山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］.此类药物在ail的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］.我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ali时nfκb活化、tnfαmrna表达及balf中tnfα,il8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ali的可能机制.

1材料和方法

1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5kg，由本校动物实验中心提供.lipopolysaccharide（o111:b4，lps，sigma）；nepertm试剂盒（pierce）；gelshiftassay试剂盒（promega）；γ32patp（北京亚辉生物医学工程公司）；trizolreagent（gibco）；rnapcr试剂盒（大连takara）；elisa试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.

1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（controlgroup，cg）、创伤性急性肺损伤（injurygroup，ig）和山莨菪碱治疗（experimentalgroup，eg）3组，每组24只.ig,eg动物lps注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，cg不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素.eg动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2mg/kgiv，随后以1mg(kg/h)维持，cg和ig分别予以等量生理盐水，剂量与方法同eg.各组分别于模型建立后1,2,3,4h由颈动脉插管放血处死6只动物.立即行气管插管，用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolarlavagefluid，balf），5ml/次，共10ml，回收率70％左右.将balf1000r/min离心10min，沉淀用pbs液洗涤后用rpmi1640培养液悬浮，置于25ml培养瓶中，37℃，50ml/lco2孵箱中培养1h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度>95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.

1.2.1nfκb活性的检测用nepertmnuclearandcytoplasmicextractionreagents提取pam核蛋白，-70℃保存，bradford法测定蛋白浓度；用γ32patp标记nfκb寡核苷酸探针(由gelshiftassay试剂盒提供)（5′agttgaggggactttcccaggc3′,3′tcaactcccctgaaagggtccg5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（emsa）测定nfκb的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示nfκb的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验.

1.2.2tnfαmrna表达用trizolreagent试剂盒提取pam总rna，采用rtpcr法检测各时间点pam中tnfαmrna水平，参照文献方法设计特异引物：tnfα1：5′gctcacggacaaccagct3′，tnfα2:5′tcccaaagtagacctgccc3′，扩增产物332bp，选用βactin作内参对照，与tnfαcdna一同扩增.扩增产物行20g/l琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以tnfα和βactin扩增产物（177bp）的光密度比值来反应各组样品tnfαmrna的表达水平.

1.2.3balf中tnfα和il8含量的检测采用本校免疫学教研室的elisakit进行检测，具体操作按说明书进行.

统计学处理：各组实验数据以x±s表示，方差分析比较3组动物各采样点有关指标的差异.采用spss12.0版本统计软件包进行统计学处理，p<0.05为差异显著.

2结果

ig动物在肺损伤模型建立后均逐渐出现呼吸急促、躁动、紫绀等症状，呼吸频率从30~55次/min升至90~120次/min.eg动物上述症状明显轻于ig，其呼吸频率维持在80次/min以下，cg动物较安静，未出现上述症状，呼吸频率基本稳定在30~50次/min.

2.1兔pam中nfκb的活性cg动物nfκb活性在实验期间稳定在0.2以内.ig于模型建立后1～4h内nfκb活性均明显高于cg（p<0.01），在2h达到高峰，是同期cg的8倍.eg经山莨菪碱治疗后，nfκb活性虽然高于cg组，但明显低于ig（p<0.01），其中2h降幅最大，达30.2％（图1）.

图1兔pam中nfκb的活性变化

2.2兔pam中tnfαmrna的表达ig在模型建立后1htnfαmrna的表达即开始上升，但峰值时间较nfκb滞后1h，是同期cg的5倍，4htnfαmrna的表达较前有所下降，但仍明显高于cg（p<0.01）.eg经山莨菪碱治疗后各时间点tnfαmrna的表达较ig均有明显下降（p<0.01，p<0.05），最大降幅出现在2h，达34.5%（图2）.

图2兔pam中tnfαmrna的表达

2.3兔balf中tnfα和il8的含量ig在模型建立1h后balf中tnfα和il8含量即开始上升，3~4h达到高峰，明显高于cg（p<0.01），与同期pam中tnfαmrna表达水平的变化相一致.eg经山莨菪碱治疗后各时间点balf中tnfα,il8含量较ig相比均有明显下降（p<0.01，p<0.05），最大降幅分别出现在3,4h，为30.7%,35.7%（表1）.表1兔balf中tnfα及il8的含量

3讨论

机体受到创伤、感染、休克等多种原因刺激后，可引起全身炎症反应综合征（systemicinflammationresponsesyndrome,sirs）导致ali和ards，创伤和感染是两个重要因素，其发病机制复杂，涉及众多炎症介质及细胞因子［5-6］.nfκb是参与炎症反应的重要信号转导分子，通常与抑制蛋白iκb结合成无活性形式存在于胞质中，当细胞受感染、氧化剂等刺激后，iκb被水解，使nfκb的核定位序列暴露，与多种炎症介质（tnf,il1,il6,il8等）基因启动子或增强子中存在的κb序列结合，启动和调节其基因转录，与ali关系密切［7］.我们发现：肺损伤模型组动物在撞击及注射lps后1～4h内nfκb活性明显高于对照组（p<0.01），高峰出现在模型建立后2h.pam中tnfαmrna的表达水平在模型建立后1～4h内较对照组亦有显著升高（p<0.01），其高峰出现在3h.同时，balf中tnfα,il8的含量与对照组相比也有明显升高（p<0.01）.nfκb活性和tnfαmrna表达峰值水平的先后顺序性提示：创伤及lps引起pam中tnfα释放增加的机制可能是创伤及lps的刺激可活化pam中的nfκb，后者可上调tnfα的基因转录和蛋白合成，从而激发逐级放大的瀑布样链锁反应.

山莨菪碱是从植物中提取的一种生物碱，临床广泛用于治疗感染性休克、平滑肌痉挛、微循环障碍及各种神经痛等疾病［3］.近年来用于防治ali，显示出良好的效果，但具体作用机制不明［4,8］.本实验结果显示：对创伤性ali家兔给予山莨菪碱治疗可有效缓解家兔呼吸困难、紫绀等症状，显著降低pam中tnfαmrna的表达及balf中tnfα和il8的含量（与损伤组比较，p<0.01，p<0.05），其最大降幅出现在2～3h，并且可明显抑制pam中nfκb的活化（p<0.01，p<0.05），其最大降幅出现在2h，较tnfα的最大抑制时间提前.以上结果提示：山莨菪碱对tnfα及其下游细胞因子的抑制作用可能是通过nfκb实现的，nfκb可能是山莨菪碱体内作用的靶因子之一.

山莨菪碱通过对pam中nfκb活化的抑制，下调了tnfα基因的转录及蛋白的合成，从而减少了balf中tnfα及后续细胞因子il8的释放，从源头阻遏了炎性细胞因子的瀑布样链锁反应，对ali的发生与发展具有抑制作用.至于山莨菪碱是通过什么途径来抑制nfκb的活化以及具体机制如何，尚待进一步研究.

【参考文献】

［1］leaversk,evanstw.acuterespiratorydistresssyndrome［j］.bmj,2007,335(7616):389-394.

［2］miskolciv,rollinsj,vuhy,etal.nfkappabispersistentlyactivatedincontinuouslystimulatedhumanneutrophils［j］.molmed,2007,13(34):134-142.

分子生物学实验篇6

[关键词]医学分子生物；实验教学；教学改革；医学检验

21世纪是生命科学的世纪，生命科学的发展伴随着探究技术的提升和人才的培养。在科学发展过程中，分子生物学的理论和技术已与生物学，医学和药学等众多领域交叉、融合，是提高探究技术水平和人才质量的一门重要学科[1]，因此，作为医学人才培养的医学院校，医学分子生物学是不可缺少的一门学科。目前，我校仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设医学分子生物学的理论和实验教学。本文总结了一些在医学分子生物学实验课教学过程中的心得和体会，希望通过不断的反思和改进培养出满足社会和人民需要的高素质人才。

1医学分子生物学实验课的主要特点

医学分子生物学是一门理论与实践相结合的医学基础学科，以核酸和蛋白质为研究对象，利用先进的分子生物学实验技术对临床疾病进行诊断，特别是进入21世纪后的短短几年，无论是疾病发生、发展机制的阐明，患病风险的预测与评价，还是疾病的早期诊断和个体化医疗的开展，都愈来愈依靠和依赖分子生物学[2]，常见检测内容包括微生物检验[3]、肿瘤诊断[4-5]、遗传病诊断[6-8]和人体各类免疫疾病[9]等。

临床中应用医学分子生物学技术的項目很多，但目前学院针对医学生开设的分子生物学实验项目有限，例如小鼠肝组织DNA提取和保存，琼脂糖凝胶电泳检测核酸，PCR技术等。然而，医学分子生物学技术发展迅速，传统的医学分子生物学实验室仅结合学院现有的条件开展分子生物学实验教学项目，内容陈旧，技术简单，缺乏临床结合，不利于学生动手能力和创新能力的培养。随着分子生物学的不断发展，越来越多的高等学校将分子生物学设为必修课和选修课。我们作为国家医学人才培养的摇篮，随着技术的更新和发展，国家和社会对医学分子生物学重视程度的增加，这对老师和学生提出了更高的要求，教师应不断更新教学内容和实验技术，学生应掌握理论知识和实验技术，设计实验紧密结合临床，紧跟科学技术发展的步伐。

2目前医学分子生物学实验教学面临的问题

2.1分子生物学实验室建设不足

医学分子生物学是21世纪研究的新兴学科，主要以核酸和蛋白质分子为研究对象，对实验室的条件和设备的投入要求较高，然而目前学院对分子实验室建设的重视程度不高，通常与其他学科共用实验室，实验环境达不到标准，仪器共用、陈旧且破损，使得分子实验不能顺利开展；分子实验的目的是通过将理论知识应用于实践进而培养学生的动手能力、结果分析能力和创新能力，但分子实验试剂和耗材均需进口，价钱昂贵，在实验试剂和耗材使用方面不能满足人人均有，导致大部分学生没有参与实验，降低了学生对分子生物学实验课的积极性。分子生物实验均需要低温高速离心，为了提高分子实验结果的成功率，低温高速离心机是分子生物学实验室必备的，且每个教室最少配备一台低温高速离心机。在核酸电泳检测过程中，需要使用溴化乙锭（EB）或其替代物染色，而溴化乙锭为强致癌物质，因此，实验室需要设置EB专用实验台，避免学生操作不当引起实验隐患；对于核酸电泳结果均要在紫外灯下检测，紫外灯下不利于实验结果的分析，也不能确保所有学生都能观察到实验结果，准确分析实验结果，学院应在学生教室配备多媒体，将每个实验结果直观地展现给学生，让学生观察并分析，带动学生的积极性，因此，为了培养社会和国家需要的创兴型人才，学院应该加强分子实验室的建设，建立单独的分子生物学实验室，对相应仪器和耗材的采购应给予大力支持。

2.2实验用品准备不规范

分子生物学实验对试剂和耗材洁净度高，且试剂名均为英文，分子生物学这门课程的理论和实验内容在学院的开设时间较晚，现在从事分子实验耗材准备的老师专业和英语水平有限，在实验试剂、耗材和仪器准备过程中空难重重，且准备不全面，影响实验的顺利开展。为了促进分子生物学实验顺利进行，降低实验准备中试剂和耗材的损失，实验室或代课教研室应对实验技术老师进行规范性培训，如RNA提取过程中使用的吸头和离心管均为无RNase，学生实验开始前应组织实验老师了解实验条件的严格性，在口罩和手套配备齐全的基础上，将吸头放置配套的吸头盒内，而不是随意将吸头倒在一次性手套上，这将误导学生对分子生物学实验严谨性的认识。学院也可以相应的引进分子生物学背景的实验技术老师从事教辅或教学工作，这对于分子生物学实验顺利而准确的进行起到重要作用。

3医学分子生物学实验课教学心得

3.1完善分子生物学实验内容和指导手册

分子生物学是跨越生物、医学、农学乃至药学的一门新型学科，优质的分子生物学实验课程开设离不开与相关专业的紧密渗透[10]。目前我院仅对医学检验专业和医学实验技术专业开设分子生物学实验，这就要求教师结合学生的专业和发展方向设计实验内容。只有结合学生的专业才能更好的将理论和实际相结合，激发学生的积极性。在目前教学中，只能依据实验室的环境和设备的变化，结合教学老师主持的科研课题开展一些简单的分子生物学实验，而忽略了结合学生的专业开设特色的实验内容。由于固定的实验材料和内容多变，没有完善的分子生物学实验指导手册，这使学生对即将做的实验毫无头绪，降低了学生学习分子生物学的积极性，不利于学科的发展和创新人才的培养。

3.2建设师资队伍

分子生物学实验内容设计，实验方法的使用以及实验结果的解析与教学老师的知识背景和能力具有紧密的联系，也是确保良好教学质量的关键。目前我们生物与分子生物学教研室的老师分别承担国家自然科学基金，省级科学基金、省级教育厅课题以及校级课题等多项科研项目，且均为硕士研究生以上学历，具有较扎实的分子生物学理论基础和熟练的分子生物学技术，可以巧妙灵活的为学生设计相关的分子实验内容。但是分子生物学内容和技术更新换代，学院可以提倡或执行“送出去，引进来”的政策，让教师得到全面的提高，让学生拓宽眼界享受先进的知识课堂。

3.3提高学生的重视度

分子生物学是一门抽象难懂的技术学科，学生对分子生物学的理论和技术应用了解的并不多，所以学生对分子生物学理论学习和实验操作均表现为消极，应付的心态。导致学生对分子生物学不重视态度的原因之一，是学生没有了解到分子生物学在临床或是研究生生活中的重要性。目前，我们教授的学生为大三学生，已经有了很强的思考能力，对自己的发展有了一定的规划，为了提高学生对分子生物学的重视程度，学院可以安排学生进入实习单位，比如医院，检测单位或是一些科研机构，让学生在实实在在的生活中了解分子生物学的中重要性以及操作过程的规范性；也可以举办学生经验交流会，让学院已经毕业工作的学生、实习的学生或者读研究生继续深造的学生分享分子生物学的重要性，提高学生的自主学习能力和对分子生物学由衷地热爱。

3.4增加多媒体教学

多媒体课堂教学已成为理论课上必不可少的教学手段，但在实验教学中应用的较少。分子生物学是通过多种先进技术手段研究核酸等生物大分子的功能、形态结构及其重要性和规律性的科学[11]。其内容抽象，枯燥无味，实验结果无法直观地展现给学生，使学生很容易产生厌学的情绪[12]。为了提高教学质量，我们应该利用多媒体将一些难懂的分子生物学技术原理和过程通过动画、幻灯片和视频等直观地展现给学生，如大肠埃希菌质粒的提取和检测，PCR技术的原理和操作过程等，使学生在轻松愉快的氛围下，快速掌握分子生物学知识。实验结果检测过程中，我们可以通过多媒体将检测的结果展示给学生，让学生观察讨论，给出依据并提出相应的答案，教师通过分析学生的討论结果，了解学生的思维动态，并给出正确结果。根据学生的反馈，板书教学结合多媒体展示利于学生对知识的认知和掌握。

3.5开放实验室

要想成为一名国家需要的优秀人才，除了掌握扎实的理论知识，具有熟练的实验室操作技能，同时也要具备活跃的创新思维。因此，为了更好地培养学生的各方面能力，实验室可以结合实际课程开放实验室，让学生查阅文献，巩固理论知识，应用实验课上的分子生物学技术结合临床疾病设计实验，给学生提供更多的动手机会，培养学生的自主学习能力和创新能力[13-15]，同时提高学生对分子生物学课程的兴趣和重视。在开放实验室期间，至少安排一位指导教师，既规范学生的操作技能，又可以帮助学生分析实验结果，这样培养学生的思考能力和分析问题的能力。目前学校仅对医学检验专业和医学实验技术开设医学分子生物学实验课，开放分子生物实验室，不仅让已学习分子生物学的专业的学生巩固理论知识和实验课内容，也为其他医学生提供了学习机会和创新平台。

3.6鼓励学生参与教师科研

生命科学的研究离不开分子生物学技术，目前学校的教师均有自己的研究课题，学生可以适当参与教师的科研工作，了解分子生物学的重要性，增强学生学习的主动性和积极性。学校也为学生开设大学生创新项目，学生将学习的分子生物学理论和实验技术结合临床设计实验，大大地发挥学生的主观能动性，激发学生的求知欲和创新能力。科研和教学的相互结合，相互渗透，不仅丰富了分子生物学实验教学的内容，也提高了学生的综合素质和科研思维[16]，为国家和社会培养更优秀的人才。

3.7改革实验成绩评定方法

常规的实验成绩评定是根据学生提交纸质的实验报告进行评定，然而，医学分子生物学实验课不仅仅评定学生掌握的理论知识，同时考察学生们的动手能力、分析结果能力、创新能力等，因此，将医学分子生物学实验成绩评定内容分为实验理论测评和实验操作技能测评，实验理论测评包括实验原理，实验步骤以及实验内容的应用，这样有利于学生自主学习医学分子生物学并加深对分生生物学的认识；实验操作技能的测评：考察学生的实验设计能力、动手操作能力、实验结果分析能力。经过观察实验课堂学生的表现，部分同学主动参与到实验课堂中，而其他同学仅仅是旁观者，通过实验成绩评定的改革，提高学生实验设计能力、自主动手能力和分析问题能力，为国家和社会培养创新人才具有重要的意义。

4总结