细胞免疫治疗范文篇1

【关键词】恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免疫治疗

【Abstract】ObjectiveToexploretheapplicationofflowcytometryforthechangesofmultipleimmuneindexesinperipheralbloodofmalignanttumorpatientsandtheclinicvalueoftheindexesfortheimmunotherapyofmalignanttumor.MethodsFlowcytometrywasemployedfordeterminingeightindexes，includingCD3、4、8，et.of50malignanttumorpatientsand31healthypersons.Furthermore，theresultsbeforeandafterimmunotherapyof10patientswerecompared.ResultsImmunefunctionofmalignanttumorpatientsisgenerallydisordered.1.Boththecellimmunityandthebodyfluidimmunityarelow.2.ThelevelofactiveTlymphocytesaregreatlyhighwiththecontrol(P<0.01).3.Forthetencaseswhoreceivedimmunotherapy，whichhavestatisticdifferencecomparedbythatbeforethecourse(P<0.01).ConclusionDetermininglymphocytesantigensbyflowcytometryprovidesaneffectivebasisforevaluatingtheimmunefunctionoftumorpatientsinclinic.ImmunotherapycanbeactiveTlymphocytesoastoimproveimmunefunction.

【Keywords】flowcytometry；malignanttumor；lymphocyte；clusterofdifferentiation(CD)；immunotherapy

恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD20)，NK细胞表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标(CD3/HLA-DR、CD3/CD25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。

1资料与方法

1.1研究对象2003年8月～2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄29～65岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄29～53岁，平均41岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素Ⅱ30万U皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。

对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄36～50岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(P＞0.05)。

1.2材料与仪器小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD19、CD20、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25及同型对照、红细胞裂解液(OptilyseC)均为法国Immunotech公司出品。流式细胞仪(EpicsXL·MCL)是美国BECKMANCOULTER公司生产。

1.3研究方法使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。

1.3.1淋巴细胞表面标记取荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD19、CD20各10μl放入试管中，分别加入外周全血100μl，室温避光孵育15min。并作同型对照。

1.3.2溶血加入OptilyseC500μl，混匀，室温避光10min。

1.3.3洗涤离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀。重复洗涤1次。

1.3.4重悬加入1mlPBS，混匀，制成单细胞悬液。

1.3.5检测上机，每个样品检测5000个以上细胞，用FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用SPSS进行统计学处理。

2结果

对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1。

对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T淋巴细胞抗原的表达进行了FCM测定，发现CD4+、CD3+、CD4/CD8比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+治疗前均较治疗后有显著性升高((P<0.01)，见表2。表1病人组与对照组淋巴细胞表面抗原及T淋巴细胞活化抗原表达的比较(%，x±s)

注：与对照组相比，*P<0.01，**P<0.05

表210例肿瘤病人免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T细胞抗原表达的变化(x±s)

注：与治疗后相比，*P<0.01

3讨论

肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后［1］。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clustersofdifferentiation)进行了定义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归［5～7］。

3.1T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关系大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主［8］。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。T淋巴细胞进一步分化为辅T淋巴细胞(Th，CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts，CD8+/CD3+)，对于抗原刺激的应答，辅T淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。McMichael认为［9］T淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，Th和Ts细胞之间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用［18］，CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸［10，11］。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生［12］。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+，CD4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(DC)，则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子激活CTL细胞、巨噬细胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+、CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组CD8+/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下(P<0.05或P<0.01)。

3.2B淋巴细胞及表面抗原(CD19、CD20)与肿瘤的关系肿瘤的体液免疫是B细胞及抗体依赖的杀伤作用。B细胞表面免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱导T细胞对肿瘤的应答。B细胞所产生的抗体是多克隆异源性抗体。CD20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是B细胞的特异性标志，前B细胞至活化B细胞时表达这一分子。而CD19作为全B细胞表面标志性抗原，是B细胞活化的共受体［13］，在B细胞活化后消失，在外周血中正常分布为8％～15％。通过对CD19与CD20的检测，可在一定程度上反映出机体体液免疫功能状态［14］。本文对50例肿瘤病人的CD19、CD20进行检测，其中恶性肿瘤病人组CD19与CD20明显低于健康对照组(P<0.01)，表明肿瘤体液免疫也明显受抑制，与文献报道一致［15］。

3.3NK细胞及表面抗原(CD16、CD56)与肿瘤的关系NK细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。NK细胞是不同于T、B淋巴细胞的淋巴细胞群，它们在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞。它们不需预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞［16］。虽然NK细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和ADCC效应时，它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的NK细胞克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式。NK细胞代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并通过T细胞补充特异性抗肿瘤应答。在某种意义上说，NK能强烈杀伤肿瘤细胞。有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90％以上是激活的NK细胞［17，18］。NK细胞表面标志主要是CD16和CD56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降提示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用［2］。陆云等认为［19］CD16或CD56细胞数与NK细胞活性相关性随不同疾病及疾病不同阶段而变化。张峻梅等［20］认为，肺癌病人NK细胞数与正常对照无显著性差异。本文对50例肿瘤病人和31例健康人的NK细胞即CD3+/CD16+56+进行比较，恶性肿瘤病人NK细胞较对照组显著升高(P<0.01)。这并不说明恶性肿瘤病人在细胞免疫和体液免疫降低时，NK细胞数量和活性增加。NK升高只是一种假象，因为测定时T+B+NK的值应在95％～105％之间［3］，而T、B细胞值均降低，为了维持总淋巴细胞数量的恒定，NK的测定值升高，其实恶性肿瘤病人的NK细胞活性是降低的。

3.4活化淋巴细胞及表面抗原(CD25、HLA-DR)与肿瘤的关系静止T淋巴细胞在接受刺激后可发生增殖活化而形成效应细胞，表现为细胞因子的分泌及细胞因子受体和粘附分子在细胞表面表达。T淋巴细胞活化需T细胞受体与相应抗原结合为第一信号，同时又必须辅以第二信号即共刺激分子的结合，而T淋巴细胞的分裂增殖是以细胞因子与IL-ɑ受体(IL-2R)的结合为启动信号的，故可以通过检测T淋巴细胞的CD3+/HLA-DR+、CD3+/CD25+等活化抗原来监测T淋巴细胞活化状态。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人CD3/HLA-DR和CD3/CD25进行测定，发现恶性肿瘤病人CD3+/HLA-DR+显著降低(P<0.01)，表明活化T细胞减少，但其中并不说明没有产生活化T细胞，而是因总T细胞减少而导致其数值降低；CD3+/HLA-DR-升高，静止T细胞则相应增多(P<0.05)；CD3-/HLA-DR-显著降低(P<0.01)，表明活化B、NK细胞也减少；而CD3+/CD25+无显著变化(P＞0.05)；体外的活化T淋巴细胞试验证明，许多细胞因子可增强HLA-DR的表达，如IFN、IL-1、TNF-2等，从而增强机体的细胞免疫功能和抗肿瘤效应［21］。本文对10例恶性肿瘤病人应用白介素-Ⅱ和高聚生治疗3个月后，所测活化T、B、NK淋巴细胞较治疗前显著升高(P<0.01)，表明T、B、NK细胞开始活化，而CD3+/CD25+细胞无明显增加，可能与白介素-Ⅱ治疗病例较少有关。此外，本文检测结果还发现CD3+与CD3+/HLA-DR+呈正相关性(r=0.49，P<0.01)。

3.5免疫治疗与肿瘤的关系免疫既影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。许多研究表明，患有肿瘤的个体可对肿瘤产生免疫抑制。随着人们对人类肿瘤抗原分子的认识，肿瘤细胞具有抗原性并能引起抗体免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础。免疫治疗作为癌症治疗方法的一种，主要通过宿主天然防御机制或天然哺乳动物材料做药物而发挥抗肿瘤效应，生物疗法是继手术、放疗、化疗之后，已成为癌症治疗的第四种重要方法。本文结果提示恶性肿瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治疗可改善病人T淋巴细胞的数量和比例；同时，亦可直接刺激T淋巴细胞的活化，增强机体细胞和体液免疫功能。

体外试验中，IL-2的使用提高了淋巴细胞对肿瘤的反应性［22］，IL-2用来刺激产生LAK细胞，LAK细胞可依一种非MHC限制方式识别新鲜肿瘤细胞，而不识别正常细胞［23～25］，从而对肿瘤细胞产生免疫应答。本文对10例恶性肿瘤病人进行高聚生、IL-2免疫治疗，并观察治疗前后各分子的变化，其中CD4+/CD3+、CD3+、CD4/CD8比值、NK细胞(CD3+/CD16+56+)、活化T淋巴细胞(CD3+/HLA-DR+)，活化B、NK细胞(CD3-/HLA-DR+)较对照组均显著性增高(P<0.01)。这表明经过免疫治疗后，体内肿瘤分泌的可溶性免疫抑制因子减少，机体通过T细胞的免疫应答，导致CD4+T细胞活性加强，调节激活了T、B、NK细胞的功能，从而改善了机体的细胞免疫功能。【参考文献】

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细胞免疫治疗范文

【关键词】树突细胞恶性神经胶质瘤免疫疗法DC疫苗

中图分类号：R739.4文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）11-407-02

恶性神经胶质瘤定植在中枢神经系统中，这一特殊的解剖学位置导致人体自身对于肿瘤的抗击能力极低。这也是导致其预后差的主要原因。由于其高死亡率，恶性神经胶质瘤曾一度被人们称为绝症。因此，寻找新的治疗方法也成为医学界的研究热点。免疫疗法逐渐被发现，并在不断壮大的分子生物学和基因工程学的技术支持下得以快速成长。在多种免疫治疗方案中树突细胞肿瘤疫苗激发患者产生主动免疫效果最佳，此种疫苗的开发与优化已成为当前的研究热点。

1神经胶质瘤免疫治疗的难点

首先脑实质有血脑屏障的保护，且缺乏淋巴组织和树突细胞，导致其不能与中枢神经系统以外的组织一样可以将外来的抗原吞噬并呈递给周边的淋巴器官产生相应的免疫反应[1]。其次肿瘤组织可以营造出免疫抑制的环境以利于继续增长。肿瘤细胞不但可以分泌一些免疫抑制因子，如白介素10、前列腺素E2、肿瘤生长因子α等，还可以低表达主要组织相容性复合体和共刺激因子B7逃避免疫提呈[2]。

2树突细胞在神经胶质瘤免疫治疗中的作用特点

就像上段所描述的，如不克服中枢系统这种免疫妥协的状态，免疫治疗的效果是无法达到的。因此在体外培养致敏细胞，再回输病人体内以达到治疗效果是必要的。在细胞免疫疗法中常被用到的有淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、DC承载胶质瘤抗原激活的细胞毒性T淋巴细胞，在MTT法分别对它们杀伤肿瘤效果的测试中可以看到DC诱导的CTL明显强于其他[3]。

通常有两种途径来激活T细胞。一是直接的方式，其中肿瘤抗原直接提交，随后激活T细胞和抗原特异性T细胞。另一种是间接的途径，利用专属的抗原提呈细胞去提呈抗原和激活T细胞。DC是迄今已知的最有力的抗原提呈细胞，当炎症介质和病原体的刺激下，定植在周边组织的未成熟DC有效地识别和处理抗原，将其呈递给淋巴器官中的T细胞区并且发育成熟。成熟的DC会失去抗原捕获能力只能以人白细胞抗原（HLA）限制的方式将内源性和外源性抗原呈递给幼稚的T细胞。CTL被认为是在肿瘤抑制过程中发挥主要效应的细胞。DC的注入已成为延长患者生命，减小肿瘤体积的重要措施[4]。

DC为基础的癌症免疫疗法是指接种携带各种肿瘤抗原的DC疫苗。理论上，DC和共刺激分子或DC生长因子的同步注射不仅会刺激各免疫效应细胞，而且还提高抗原对DC的提呈[5]。大量证据表明，利用DC的免疫疗法似乎能够克服，至少部分克服，处于免疫抑制状态的原发恶性胶质瘤患者治疗的难题。DC治疗在动物模型和临床试验中的安全性已被证实。到目前为止，尚无严重的副作用，也没有自身免疫毒性的发生。因此，此种疗法得到了越来越广泛的关注[6]。

3神经胶质瘤DC疫苗的制备

理论上已知和未知的肿瘤抗原都可以与DC结合，在体外特定的环境下培养DC使之致敏，并且促进其分化成熟，具有抗原提呈功能。目前部分技术已应用于临床，更加成熟的技术尚在研发中[7]。

3.1胶质瘤全细胞抗原致敏DC

其优点在于不必苛求具体的抗原识别表位，因而，适用范围较广泛，并可避免变异株或缺陷株的免疫逃逸和转移扩散。更重要的是其制备方法较简单适合大量生产，可应用反复放射线照射等物理方法获取肿瘤细胞抗原，然后致敏DC制备的疫苗。有专家已通过此法制备好疫苗后实行有对照的动物实验，实验结果表明疫苗的疗效显著，孟庆海等以反复冻融的C6细胞裂解物致敏DC制备疫苗,设立疫苗实验组和盐水对照组，再分别以颈内动脉，尾静脉和皮下三种不同注射途径回输荷C6胶质瘤大鼠，发现大鼠生存期和肿瘤坏死面积，均是实验组大于对照组，而与给药途径无关[8]。相关临床实验也正在筹划中[9]。

3.2胶质瘤抗原多肽负载DC

利用肿瘤抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后回输患者体内可以激活CTL，产生免疫反应。此法靶向性较好，而且肿瘤抗原肽可人工合成，或弱酸洗脱肿瘤表面的MHC-I类抗原肽获得。有专家已在动物实验中证明此法的有效性，更有I期临床实验证明实验组的患者中位生存期显著延长[10]。

3.3胶质瘤细胞DNA或RNA负载DC

此法可有效的避免自身免疫反应，并无需明确肿瘤特异性抗原，但技术要求较高。有国外专家尝试将人端粒酶反转录酶基因插入质粒和腺病毒然后转染DC并成功激起了T细胞反应。国内专家又将肿瘤RNA与DC混合，使之致敏，未致敏的DC为对照组，将DC与外周血T细胞共培养，采用MTT比色法检测T细胞抗肿瘤活性差异，结果是实验组胶质瘤细胞的生长受到抑制，并最终死亡，杀伤率与对照组相比差异有统计学意义(P

3.4胶质瘤细胞与DC融合体疫苗

理论上此法可满足具有肿瘤细胞的全部抗原性又具有激活T细胞的功能。经过实验证明融合技术目前电融合的效率较化学融合高。多名专家实验证明DC肿瘤融合疫苗治疗脑胶质瘤的技术是可行的[12]。王东海等采用PEG化学融合方法制备融合瘤苗，制备大鼠颅内C6肿瘤模型，经尾静脉注射融合瘤苗、DC以及PBS，证明融合瘤苗能够有效地发挥抗肿瘤效果[13]。付玉等在PEG作用下将DC与胶质瘤细胞BT325融合，结果是DC/胶质瘤融合细胞激活的CTL对胶质瘤的杀伤作用，显著高于DC与胶质瘤细胞联合培养DC组(P

3.5Exsomes负载DC

Exsomes是一种由致敏DC分泌的具有抗原呈递能力的物质，其表面可表达共刺激分子、勃附分子和MHC分子等，并能引起强烈的肿瘤特异性免疫反应。已有相关实验证明其有效性[15]。

4展望

有分子生物学和基因工程学的成熟技术支持，DC研究的深入已成为一种趋势，以DC为主体的神经胶质瘤的免疫治疗取得了长足的进步，对于不同病人采取不同制备特异性DC疫苗的个体化研究已经进人临床试验。目前，免疫治疗仍为以手术治疗为主的综合治疗的补充治疗措施。手术、放疗、化疗、免疫治疗综合治疗已成共识，相信随着此项技术的成熟，及相关实验的不断完善，免疫疗法终将占据更加重要的地位。此项治疗方法的迅猛发展，终究会为人类有朝一日彻底攻克免疫原性低、侵袭性强、易复发的神经胶质瘤的治疗带来希望。但DC疫苗的研究时间毕竟很短，在临床推广应用之前还有许多工作等着我们去完成，其中最重要的是安全性和疗效问题，因此寻找规范化的合理的经济的DC疫苗制备方法必将成为重中之重，需待临床及科研工作者去开发和研究。

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细胞免疫治疗范文

【关键词】树突细胞；直肠癌；疫苗；免疫疗法

直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌和食道癌，是大肠癌的最常见部位（占65%左右），且患病人群以中老年为主。由于老年人的脏器功能较青年人有所减退，且易患多种疾病，故老年人直肠癌相对中青年有其特殊性。对于直肠癌处理的手段通常所采用的方法是直肠系膜的整体切除并结合放射疗法。但是复发率高，严重影响了患者的生活质量〔1〕。目前，免疫治疗已经被认为是继放疗、化疗、手术切除之后的第4种肿瘤治疗模式，主要有肿瘤抗原疫苗、多肽疫苗、基因疫苗以及树突细胞（DC）疫苗等，其中以DC疫苗为基础的主动免疫治疗，已成为最近研究的热点〔2〕。

1直肠癌免疫逃逸机制及免疫耐受表现

人体的免疫系统在防止肿瘤发生过程中起着关键性作用。现已证实，人体免疫系统的功能缺陷是造成肿瘤免疫逃逸的主要机制之一，并且还制约着肿瘤免疫疗法的效果〔3〕。

1.1肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)凋亡机制近些年发现，很多肿瘤组织中都存在TIL，TIL在肿瘤免疫中的作用非常重要。它可通过Fas系统或释放颗粒酶、穿孔素杀伤肿瘤细胞。但是，当直肠癌细胞表达Fasl时，Fasl可诱导TIL发生凋亡，进而反击机体免疫系统，一定程度上诱导了肿瘤的免疫逃逸，而且肿瘤抗原EpCAM与人类白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR1)相结合后，可直接对细胞免疫反应产生抑制作用〔4〕。

1.2直肠癌免疫耐受表现直肠癌细胞能够通过多种机制诱导免疫耐受，表现为：Th1细胞凋亡，Th2细胞极化，调节性T细胞数量增加，T细胞和NK细胞CD3复合物ζ链表达下调，外周血中不成熟细胞增多，而且血清中TGFβ、IL10等细胞因子浓度升高〔4〕。鉴于DC的免疫学特性以及类浆细胞DC抗原提成作用的新进展〔5〕，DC已经成为直肠癌治疗的一种潜在手段。

2DC的免疫学特性

DC由美国学者Steinman〔6〕于1973年发现，是目前所知功能最强大，并且是惟一能激活初始性T细胞的抗原提呈细胞。DC可有效地诱导初始T细胞的增殖和应答，促进CTL和辅助性T细胞(Th)的生成。根据DC的来源，可将其分为骨髓来源DC和类浆细胞DC两类〔7〕。

未成熟DC常位于抗原易于入侵部位，如肠黏膜，它们能够特异性捕获抗原，但缺乏激活T细胞的能力〔8〕。随着DC逐渐分化成熟，它们伸出许多树突样或伪足样突起，渐渐移至外周淋巴器官，发挥抗原呈递作用，并与抗原特异性T细胞相互作用而启动免疫反应。

DC是人体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可通过表达MHCⅠ和MHCⅡ分子等途径提呈抗原。DC表达的MHCⅠ类抗原的量要比巨噬细胞多5～20倍，而MHCⅠ类抗原正是所有抗原提呈细胞将抗原提呈给T细胞的中介分子，因此，DC的抗原提呈能力比巨噬细胞高10～30倍〔9〕。由此可见，DC在免疫监视、抗原的摄取和搬运等方面均有一定作用。

3DC与肿瘤的关系

DC与肿瘤的关系密切。一般来说，人体肿瘤微环境中的DC及肿瘤浸润DC(TiDC)的数量、功能与肿瘤的预后呈正相关。Ishigami等〔10〕检测了胃癌患者肿瘤组织中TiDC的表达，结果显示:DC浸润程度与患者远处淋巴结和腹腔转移以及病情恶化程度呈负相关。对某些实体瘤内的DC浸润程度研究亦证明TiDC数量愈多，则患者预后愈好。所以，TiDC在肿瘤的免疫激活与免疫耐受中均有一定作用。

大多数肿瘤组织中DC的含量有限，且多数处于未激活状态，这与肿瘤产生的细胞因子对DC的影响有关。例如：TNFα抑制DC对特异性CTL细胞的激活；血管内皮生长因子（VEGF）抑制DC前体分化发育为成熟的DC；IL10抑制DC表达刺激分子B7。

总之，在肿瘤组织内，肿瘤细胞可以通过释放免疫抑制因子造成DC的功能缺陷，使其无法有效的呈递抗原，而且，这对T细胞的活化及其功能均有一定抑制作用。

4直肠癌的DC疫苗

直肠癌患者往往预后较差，并且复发率高。经过研究者的不断探索，以树突细胞为疫苗治疗直肠癌已经取得了较为显著的成果。

4.1直肠癌细胞裂解产物致敏DCBurgdorf等〔11〕应用直肠癌患者的外周血单核细胞，经含有肿瘤细胞表面抗原的肿瘤细胞裂解物反复冲击，从而致敏DC形成疫苗。对17例直肠癌患者每人2w注射1次疫苗，共注射10次。依据国际癌症研究组织的分级标准进行评定，其中4例病情得到了稳定。对患者的后续研究证明，DC疫苗的治疗方法安全、无毒性，其对于直肠癌的病情稳定率可达24%(4/17)。

4.2肿瘤相关抗原肽负载DC疫苗肿瘤抗原肽致敏的DC具有很好的靶向性。这种DC能显著诱导机体CTL的激活，进而产生抗肿瘤免疫，发挥一定的保护性作用。Ueda等〔12〕最近从13例肿瘤晚期患者的外周血中成功诱导了成熟的DC，用癌胚抗原(CEA)抗原肽对DC进行修饰，进而制备肿瘤疫苗，并对此方法的有效性和安全性进行了检测。某些体外实验亦表明该类DC疫苗可明显引起肿瘤患者的特异性免疫反应，刺激T细胞的增殖，对肿瘤细胞产生一定的杀伤作用。

4.3DC肿瘤细胞融合疫苗从理论上讲，DC与肿瘤细胞融合的致敏方法，可将全部肿瘤抗原结合于DC，使其既具有肿瘤细胞的全部抗原性〔13〕，又具有活化T细胞的功能。目前融合技术主要有电融合和化学融合两种方式，其中电融合的效率较高。从现有的技术资料来看，通过融合技术获得DC肿瘤细胞融合疫苗的方法切实可行〔14〕。一般情况下，融合技术制得的疫苗，效率高于其他以DC为基础的免疫疗法。这是由于融合后的细胞不仅具有DC的抗原呈递功能，而且还能够产生针对T淋巴细胞的MHC分子。

目前研究者发现，该种融合细胞能够防护肿瘤细胞的攻击，结果可使已产生的肿瘤逐渐消退。经过进一步的观察与研究，由自体或同种异体的DC与肿瘤细胞融合后获得的杂交细胞疫苗，在体内或体外均可表现出相同的生物学效应。这一发现表明，杂交融合疫苗的效率很大程度上取决于机体内的APC对于抗原的摄取和呈递功能〔15〕。因此，该种方法是一种很有潜力的肿瘤治疗手段。

4.4肿瘤细胞RNA负载DC肿瘤免疫疗法旨在引发机体产生针对肿瘤抗原的特异性免疫反应，而该过程的根本性反应就是DC将肿瘤相关抗原传递给T淋巴细胞。通过将负载肿瘤抗原的DC重新注入患者体内或体外扩增的方法，均可以获得抗肿瘤的淋巴细胞。应用转染等方法使活体DC负载RNA，再经RNA的表达使DC成为产生特异性肿瘤相关抗原的有效工具。并且该种方法已经开始展示出美好的前景，研究者们也在积极地设计临床研究实验〔16〕。但是特异性抗原的选取、DC细胞的活化以及给药参数等问题，仍然是限制该种方法的瓶颈所在。目前，已有学者开始在提高RNA对DC的转染率、改善抗原传递途径、以及T细胞的共同刺激等方面，寻求可使该种疫苗更加完善的方法〔16〕。

4.5Exosome融合DC疫苗Exosome是生物活性小囊泡家族中的新成员，由多泡体融合而来，至今其功能尚不完全明确。但研究表明，Exosome可以用做肿瘤抗原。DC能够将该肿瘤抗原传递给T淋巴细胞，诱导T细胞活化〔17〕。Exosome来源广泛，可由上皮细胞、造血细胞、肿瘤细胞等一系列细胞分泌。在动物实验和临床研究中发现，由负载肿瘤抗原的DC所产生的Exosome，能够诱发肿瘤抗原特异性CD8+CTL增殖活化，从而发挥抗肿瘤的免疫学效应。此种方法的优点在于能够通过无细胞的疫苗对人体的免疫系统进行有效刺激，该种特性很可能会成为提高DC疫苗治疗肿瘤效率的潜在突破点〔18〕。

4.6激发型41BB单抗联合凋亡肿瘤细胞致敏DC作为重组肿瘤坏死因子受体可溶性蛋白（TNFR）超家族的成员，41BB分子可功能性表达在DC上，而且，该分子的活化可进一步促进DC的分化和成熟，增强其激发T细胞的功能。由此，李敏等〔19〕应用凋亡小鼠B细胞淋巴瘤细胞A20负载的DC来制备APDC，A20荷瘤小鼠分别被注射APDC、2A单抗或二者联合。通过观察肿瘤生长情况及小鼠生存期，发现3种方法均有一定治疗效果。单独注射APDC或2A单抗可获得12.5％或25.0％的肿瘤完全缓解率；二者联合应用，治疗效果更好，肿瘤完全缓解率可达62.5％，并且荷瘤鼠可长期生存。治疗后荷瘤鼠脾脏T细胞体外增殖更为活跃，CD4+IFNγ+T细胞的比例也明显升高。在联合治疗荷瘤鼠的血清和脾脏T细胞的培养液上清中，IL2和IFNγ的分泌水平明显升高，而IL10的分泌水平降低。由此可见，可以通过对以激发型41BB单抗联合凋亡肿瘤细胞致敏DC的进一步研究，来不断完善此种方法，以使其早日进入临床研究阶段。

5展望

随着对DC细胞研究的进一步深入，以DC细胞为基础的免疫疗法已经取得了长足的进步，DC疫苗的构建方法也日益多样化和高效化。但是，由于对DC的研究历史较短，特别在直肠癌治疗方面才刚刚起步，DC的某些负面影响尚不明确（例如：由于DC具有潜在的分化缺陷，所以在机体的某些肿瘤刺激因子作用下容易造成机体DC的免疫耐受）。就目前来看，每一种新的方法都有其不足之处。但是，有理由相信在不久的将来，肿瘤的免疫治疗一定会实现多方法和多层面的相互结合，并且以DC为基础的肿瘤免疫治疗方法也一定会成为直肠癌治疗领域的一个新的发展方向。

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