细胞培养范文

关键词：猪；成纤维细胞；分离；培养

中图分类号：R329-33文献标识码：A文章编号：0439-8114（2017）04-0702-02

随着生物技术的发展，原代成纤维细胞已经成为非常特殊的资源[1]。由于试验材料来源广、分离培养条件不苛刻，细胞的分裂增殖能力强，适应性好，且性状稳定[2，3]，同时又能模拟体内生长状况、生长环境简化、生长条件明确、施加实验因素方便、容易获得直接活体观察结果以及方便控制培养产物等特点[3，4]，所以成纤维细胞得以广泛地研究和应用。医学上用于疾病诊断、人工皮肤、组织创伤修复、组织器官培养[1，5]；动物上用于体细胞克隆、转基因[6，7]，以实现濒危畜禽保种及扩繁、优良品种的快速繁育、转基因新品种培育；基础研究上为遗传学、细胞学、胚胎学、组织学、免疫学等提供基础材料和分离培养模式[8]。因此，建立一种快速、实用、简便的猪成纤维细胞分离培养方法成为急需。本研究比较了不同来源、不同状态组织和不同分离方法对成纤维细胞的影响，旨在为相关研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料、仪器及试剂

35d的胎猪、新生小猪、成年猪；超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、血球计数板；乙醇、PBS溶液、DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、中性蛋白酶、胰蛋白酶；青霉素、链霉素、台盼蓝、EDTA、DMSO。除了特别说明外，其他试剂均源于Sigma公司[1，7，9，10]。

1.2试验方法

1.2.1组织取样通过手术，从怀孕35d的湖北白猪母猪体内无菌取出胎儿，浸泡在PBS（100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）中，室温尽快带回实验室无菌间，在超净工作台上，用镊子去除胎儿头、尾、四肢、心脏及其他脏器，用PBS清洗后，用眼科剪将胚胎剪碎成约1mm的3小块，用PBS冲洗2次，再用相应的培养基洗1次，备用[9]；耳组织来自湖北白猪耳边沿皮肤（大、小猪均可），经剪毛、清洗、消毒、生理盐水再清洗后，在耳边沿无菌剪取多个皮肤约0.5cm2，放入PBS（100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）中，室温2h内运回实验室，在超净工作台上去除表皮及皮下组织，用PBS溶液洗涤2次，将组织剪成约1mm的3小块，用相应的培养基洗1次，备用[6]。

1.2.2细胞培养组织块培养是将组织块直接接种到培养皿上，或是将组织块用0.25%中性蛋白酶在4℃处理2～4h，剩余组织块以1～2mm间距接种于培养瓶内壁或培养皿上，加入少量DMEM培养液（含10%FBS），置于39℃的5%CO2培养箱中培养24h，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，3d后换液[1]；如果是细胞培养，则向剪碎的组织块中加入约2倍组织块体积的37℃预温的0.25%胰酶（含0.04%EDTA），在4℃中消化12～16h（期间有规律地摇晃3～4次），加入DMEM培养液（含10%FBS）终止消化；取上清液，以800r/min离心5min，弃上清液，然后加入培养液，轻轻吹打重新悬浮细胞，以5×104个/mL的密度接种于培养瓶或培养皿中[9]。

1.2.3细胞传代细胞在组织块周围生长成片时，或当培养的细胞达到85%～90%汇合度时传代。加入2mL0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA混和溶液（Gibco）消化细胞3～4min（细胞边沿开始有收缩即可），加入2mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，转入离心管，1000r/min离心5min，用培养液重新悬浮细胞，计数后以5×104个/mL的密度接种于新培养瓶继续培养，经过5～7d的生长后，细胞达到85%～90%汇合，再次按1∶3或1∶4比例进行传代培养。如此反复传代，可以进一步纯化成纤维细胞[6]。

2结果与分析

2.1组织块处理

组织细胞离开身体后非常脆弱，任何处理都会对细胞造成伤害，乙醇消毒、运输时间等会影响原代细胞的生长，其中乙醇长时间消毒对细胞的伤害最大，其次是运输时间。培养7d后，细胞的生长状况见表1。

从表1中可以看出，乙醇短时间处理组织对细胞生长没有影响，而处理时间延长会使细胞生长减慢，但这种处理对活体组织没有影响，即在组织没有离开肌体前处理，不影响组织采集后细胞的生长。

由表2可见，运输时间1～2h对细胞生长几乎没有影响，然而当运输时间达到4h时细胞生长活力开始降低，6h时已不适宜作为原代细胞分离培养。所以分离原代成纤维细胞时，取组织后应尽快运回实验室培养，这样可以提高成功率。

2.2成纤维细胞的培养与分离

从组织中开始分离的原代细胞种类比较多，而且生长不均匀，无法判断成纤维细胞（图1，图2），只有传代培养3代以上，才能得到比较纯的成纤维细胞（图3，图4）。

培养7～8d的组织块周围可见多边形细胞并向四周成片生长，培养13d时传代培养，传代后细胞生长迅速，约6d细胞即可长满培养板；消化法得到的细胞培养5d，细胞开始向周围快速生长，大约培养11～12d即可传代，传代后6d细胞长满培养板[6]。

3讨论

成纤维细胞是非常重要的供体细胞之一，无论是用组织块培养获得，还是用消化培养制备，均可获得比较纯的成纤维细胞。但前期处理会影响原代细胞的生长，特别是离体后，样品长时间储运会降低细胞的生长速度，乙醇长时间消毒处理直接抑制细胞的生长，样品离体前乙醇处理对细胞的生长影响较小。其原因可能是离体前处理，乙醇被血液及组织液稀释或带走，进入组织细胞的乙醇浓度不容易快速升高，对细胞活力影响小，而离体后组织细胞中的乙醇浓度很快达到峰植，直接影响了细胞的活力；离体组织长时间储运由于没有营养，细胞代谢受到影响，细胞活力有所降低，但影响较小。

组织块和消化法分离的细胞均可用于体细胞克隆，两者的差别在于分离细胞所用的时间长短不一，对于纯度要求不高的细胞而言，消化法比组织块法更快收获大量的1～2代细胞。其原因是原代培养时，消化法原始生长点比组织块法多很多，消化后每个细胞都可能成为一个原始生长点，而每个组织块只是一个原始生长点，组织块的数量限制了原始生长点数量。但两种方法分离到的成纤维细胞传到3代以后，其生长无差别。

参考文献：

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细胞培养范文

【摘要】本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞(dendriticcell，DC)的无血清培养方案。以含胎牛血清(FCS)、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMNC），在不同培养液中分别加入GM-CSF（100ng/ml）、IL-4（500U/ml）培养6天，再分别加入钙离子载体A23187（100ng/ml）继续培养24小时，于倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析细胞表型，MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明：无血清培养组培养出典型形态的DC，其表面CD14分子的表达明显减少，CD83、HLA-DR、CDw123分子的表达明显增高，具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较，组间无显著性差异（P>0.05）。结论：无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比，无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。

【关键词】树突状细胞；无血清培养液；钙离子载体；外周血

InVitroCultivationofDendriticCellswithSerum-freeMedium

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheprotocolinvitrotoincubatethedendriticcell(DC)derivedfromperipheralbloodmonocytesusingserum-freemediumX-VIVO20.Peripheralbloodmonocytesfromhealthydonorsweretreatedwith100ng/mlGM-CSFand500U/mlIL-4，respectively.Aftercultivationfor6days，theyweretreatedwith100ng/mlcalciumionophoreA23187.Aftercultivationfor24hoursthecellularmorphologywasobservedunderinvertmicroscope，thesurfacemarkerswereanalyzedbyflowcytometry，theproliferationofallogeneticTcellswasdetectedbyMTTcolorimetry，thespecificcytotoxicityofTcellsprimedwithDCwasexaminedbyMTTassay.Theresultsshowedthatinallthreegroupswithserum-free，fetalcalfserum(FCS)andhumanABserummediums，cellsdisplayedcharacteristicmorphologicalfeaturesofDC.SimultaneouslyCD14expressionwasdecreased，andCD83，HLA-DRandCDw123expressionwereincreasedonthesecells.Inaddition，DCsculturedwiththesemethodscouldevidentlystimulatetheproliferationofallogeneticTcell.Ascomparedwiththetwocontrolsofserumcontaininggroups，theculturedcellsintheserum-freegroupsshowedalmostthesameallo-stimulatorycapabilityandcellularmorphologyandsurfacemarkers，andTlymphocytesprimedwiththeculture-derivedDCexhibitedthesimilarkillingactivitytoK562(P>0.05).ItisconcludedthatthereisnosignificanceinDCnumbers，morphology，epitopeandabilitytostimulatetheproliferationofallogeneticTcellsbetweenDCinducedbyserum-freeX-VIVO20mediumandDCinducedbyserum-containedmedium.DCculturedandinducedbyserum-freemediumisworthusinginpracticewidely.

Keywordsdendriticcell;serum-freemedium;calciumionophore;peripheralblood

树突状细胞是Steinman和Cohn于1973年首先报道的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名［1］。它源于造血干细胞，广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中，是机体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presentingcells，APC)［2］，其最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖，是机体免疫反应的始动者。目前，多数体外培养液包含胎牛血清、混合人(AB型)血清或自体血清，由于血清中包含个体差异性的生长因子，异体血清又有外来抗原及危险感染侵入的弊端，人自体血清中又含有某些抑制DC生长的因子，这将使DC的临床应用受到限制。本实验采用无血清培养液X-VIVO20则避免了上述缺点。本实验通过比较X-VIVO20与含FCS、人AB血清的培养基对体外诱导扩增DC的影响，为进

一步优化无血清培养液条件，使DC疗法应用于临床提供实验依据。

材料和方法

材料

淋巴细胞分离液（Ficoll，密度1.077）购于上海华精生物高科技有限公司，rhGM-CSF购于华北制药集团金坦生物技术开发有限公司，rhIL-4、人血白蛋白、四甲基偶氮唑盐（MMT）、钙离子载体A23187均为Sigma公司产品，人AB血清（大连市中心血站产品），胎牛血清（民海生物工程有限公司产品），无血清培养液(Cambrex公司X-VIVO20培养液)，FITC标记的鼠抗人CD83、HLA-DR单克隆抗体和PE标记的鼠抗人CDw123、CD14单克隆抗体(BectonDickinson公司产品)。

分组

根据培养液的不同分为以下4组。A组：含10％人AB血清的RPMI1640；B组：含10％胎牛血清的RPMI1640；C组：无血清培养液X-VIVO20；D组：含20g/L人血白蛋白的X-VIVO20。

DC的诱导

静脉采集正常人外周血，用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞，分别用含10％人AB血清的RPMI1640、含10％FCS的RPMI1640、无血清培养基X-VIVO20，将细胞稀释至3×106/ml，加入24孔培养板（1ml/well）中，于37℃、5％CO2孵箱中培养2小时，轻轻洗出悬浮细胞，在培养板中分别加入含GM-CSF（100ng/ml）、IL-4（500U/ml）的4组不同培养液，37℃、5％CO2孵箱中培养，3天半量换液1次。在培养的第6天，每组分别加入钙离子载体A23187（100ng/ml）继续培养24小时，收集细胞。

DC的形态学观察

用倒置显微镜每日观察细胞生长及形态变化情况，第3、7天作细胞计数，第7天作瑞氏—姬姆萨染色，观察摄片。

DC的表型分析

收集培养7天后的细胞，通过流式细胞术分析细胞表型——CD14、CDw123、CD83、HLA-DR。

混合淋巴细胞反应（MLR）

将正常人外周血单个核细胞接种于含10％人AB血清的RPMI1640培液基中，在37℃、5％CO2孵箱中培养2小时，取悬浮细胞为同种异体T淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。将收集的DC悬液，加入丝裂霉素C25μg/ml，37℃孵育30分钟，RPMI1640培养液洗涤3次，用含10％人AB血清的RPMI1640培养液悬浮，作为刺激细胞，分别以1×104/well、5×103/well、2.5×103/well、1.25×103/well加入96孔平底培养板，每组设2个复孔，再加入1×105/well同种异体T淋巴细胞，终体积为200μl/well（DC与T淋巴细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80），另取3孔只加T淋巴细胞而不加DC，作为背景对照。37℃、5％CO2孵箱中培养3天后，每孔加入MTT（5mg/ml，20μl/well），再继续孵育4小时，终止培养，40×g离心5分钟，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10分钟，用酶标仪检测波长570nm时的吸光度（A）值，结果取平均值。计算刺激指数（SI），SI=A实验组/A对照组。

K562细胞冻融抗原的制备

取K562细胞悬液20ml，以生理盐水洗涤细胞2次后计数，用无菌生理盐水配制细胞浓度为5×107/ml的细胞悬液共2ml，放入液氮中，10分钟后迅速放入37℃水浴中，待其完全融化后，再次放入液氮中，反复冻融3次后，以360×g离心10分钟，取上清，用微孔滤膜过滤，即为K562细胞冻融抗原，4℃保存备用。

DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用

按上述方法培养DC（在培养第4天的DC中加入100μlK562细胞冻融抗原）。用RPMI1640培养液调整DC、同种异体T淋巴细胞浓度分别为1×105/ml、1×106/ml。各取DC和T淋巴细胞100μl，加入96孔培养板共培养，对照组以100μlRPMI1640培养液代替DC，37℃、5%CO2培养72小时后，加入K562细胞作为靶细胞，效∶靶=10∶1，设3个复孔。37℃、5%CO2孵育48小时后弃悬液，每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml)，37℃、5%CO2孵育4小时，终止培养，40×g离心5分钟，弃上清，每孔加入二甲亚砜溶液150μl，振荡10分钟，在酶标仪上测定各组在570nm处A值(结果用3孔均值表示)，并计算其杀伤率(%)。公式为:

细胞杀伤率(%)=［(效应细胞孔的A值+单纯靶细胞孔的A值-细胞毒实验孔的A值)/单纯靶细胞孔的A值］×100%

统计学处理

实验重复3次，所有数据以X±SD表示，采用样本均数的t检验，P>0.05为无统计学差异。所有统计学处理均用统计软件SPSS12.0forWindows完成。

结果

活细胞的形态变化

倒置显微镜下显示，最初接种的细胞为大小均等的小圆细胞，细胞表面光滑，无或仅有少数细胞集聚成簇的现象。第3天，可见细胞形态明显改变，体积略增大，胞体出现树突状小突起，到第7天，各组均可见形态变为大圆形或不规则形等、具有典型的树枝状突起结构的细胞，有细胞集聚成簇的现象，部分细胞脱壁悬浮。体外培养第7天，瑞氏-姬姆萨染色，各组均可见细胞体积增大，表面粗糙，核呈圆形、肾形、马蹄形、椭圆形等，偏位，嗜碱性染色，胞质丰富，胞膜向外伸展，形成大量形状、粗细不等的毛刺状突起，细胞突起和胞浆呈嗜酸性染色，表现为典型的DC形态（图1）。

细胞计数

细胞计数结果见表1，由表1可见随着培养时间的延长，各组DC细胞数量均增加，不同组间DC细胞数量无显著性差异（P>0.05）。Table1.AmountofDCinducedfromperipheralhumanbloodindifferentculturemedium（略）

DC的表型分析

未处理的PBMNC表面单核细胞的标志CD14分子呈高表达状态，而CDw123、HLA-DR及CD83分子的表达很弱或缺乏。培养后各组均出现成熟DC的特征性表面标志CD83分子表达增高，HLA-DR、CDw123分子的表达也明显增高，而CD14分子的表达明显减少。无血清培养基组与含血清培养基组表达相差不大，加入20g/L人血白蛋白无明显提高（表2）。不同组间差异无显著性（P>0.05）。Table2.PhenotypeanalysisoftheDCinducedfromperipheralhumanbloodindifferentculturemediumanalyzedbyflowcytometry（略）

各组DC刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力

采用不同培养液的各组DC在体外均能有效地激发同种异体外周血T细胞的增殖。D组的刺激指数比其他组略高，但不同组间差异无显著性（P>0.05）（表3）。Table3.StimulationindexofeachgroupsmeasuredbyMTTmethod（略）

DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用

T细胞经DC刺激后对K562细胞的杀伤率，各组均较以100μlRPMI1640代替DC的对照组显著增高（P均0.05），无显著性差异（表4）。Table4.KillingratioofTcellsstimulatedbyDCofeachgroupstoK563cellsanalyzedbyMTTmethod(略)

讨论

目前无论化疗或造血干细胞移植治疗白血病，都存在残留白血病细胞即微小残留病(MRD)的问题，使相当一部分患者因复发或难治而死亡。因此，如何有效清除体内MRD，有着极为重要的意义。树突状细胞（DC）可以使CTL最大限度地发挥特异性抗肿瘤效应，它能把肿瘤抗原有效地呈递给T细胞，使T细胞致敏，在肿瘤免疫治疗中起关键作用，这是一个理想的体内外消除MRD的方法。体外培养DC有3个来源:骨髓、外周血和新生儿脐血。DC可由人骨髓、脐血和成年人外周血中的CD34+细胞和人外周血中的CD14+单核细胞产生。在临床应用方面，与脐血、骨髓来源相比，外周血CD14+单核细胞来源DC的培养方法具有取材容易、培养方便、供者适用性好、成熟阶段易于调控的优点，特别是对于肿瘤免疫的研究，外周血来源DC是目前公认获得成熟DC的较佳途径。DC的培养分为启动培养和分化培养两个阶段:GM-CSF、IL-4应用7天诱导出非成熟DC；应用成熟诱导因子促使DC成熟。目前证明的促成熟因子有:①细菌菌体或其产物，如LPS；②某些病毒或其核酸；③某些有炎症介质作用的细胞因子，如TNF-α；④氧自由基供体过氧化氢；⑤单核细胞条件培养液；⑥某些刺激信号，如A23187作为一种钙离子载体(calciumionophore，CI)，能与钙离子形成稳定的复合物，充当流动的Ca2+载体，使胞外Ca2+透过细胞膜，生理性或人为地提高胞浆游离Ca2+水平，导致Ca2+结合其调节蛋白-钙调蛋白，模拟某些细胞内信号转导事件，导致多基因活化［3，4］。不成熟DC和单核细胞经CI处理均成为高度活化、成熟的DC，可以迅速表达成熟DC的标志CD83，而且两者的T细胞致敏效应相当［5］。

Czerniecki等［5，6］证实，CD83分子的表达多出现于CI处理后4小时，于20小时达高峰，48小时开始下降，96小时已检测不到，CI处理后不再表达CD14。体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、混合人(AB型)血清或自身血清的完全培养液(CM)［7］，也可以使用无血清培养液(SFM)培养［8-12］。血清可以提供细胞生长所需的基本营养物质，提供贴壁和扩展因子、激素、各种生长因子、结合蛋白，对培养中的细胞提供某些保护作用。但是，使用血清也有一些明显的缺点：血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶，它能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒作用的聚精胺；此外，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡；胎牛血清及人异体血清有外来抗原和危险感染（如乙肝、艾滋病等）侵入的弊端，易引起过敏反应，而且有MHC限制等；自体血清中含有抑制细胞生成的因子［13］，另外自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子(VEGF)和IL-10(白血病细胞所分泌)又是DC分化、成熟的抑制剂［14］，从而导致用自体血清培养DC产率低。血清的这些缺点均不利于DC瘤苗的临床应用。因此，无血清培养基诱导的DC有着广阔的临床应用前景。本实验采用的X-VIVO20TM无血清培养液具有成分明确、质量稳定、安全可靠的优点，在实验中应用无血清培养液X-VIVO20培养可以克服使用血清的缺点，具有很大的优越性。本实验用无血清培养液X-VIVO20培养出的DC与含血清的培养液培养出的DC，在细胞形态、细胞表面标志、DC刺激同种异体外周血T细胞的增殖能力、DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用方面都没有显著性差异，故无血清培养液培养DC是完全可行的，而且能够避免许多弊端，具有广阔的临床应用前景。本实验中，在X-VIVO20中加入20g/L人血白蛋白，结果无明显提高，今后可再添加其它细胞因子，进一步优化无血清培养液条件。DC在净化微小残留病变、防止复发、延长患者无病生存期方面都具有良好的临床应用前景。将无血清培养液诱导的DC尽快应用于临床、进一步优化无血清培养液的组成将是今后面临的新课题。

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细胞培养范文篇3

关键词：骨关节炎；软骨细胞；体外培养

软骨组织﹙cartilage）由软骨细胞﹙chondrocyte）和细胞外基质﹙extracellularmatrix，ECM﹚构成，软骨细胞是关节软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治疗骨关节炎、最基本最关键的一步[1]。自从1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。但不同的动物，不同的模型对软骨细胞的提取也有一定的不同。本文通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点及关键问题等。

1软骨的提取

将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6cm×6cm的区域，浸泡于75%的酒精中20～30min，放入超净台中打开膝关节腔，无菌条件下用11号刀片（带柄）削取膝关节股骨髁和胫骨平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液（1×1010U/L）的D-hanks液的无菌平皿中，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10mL漂洗3遍，用眼科剪将软骨组织剪成1mm3小块，见图1，然后再用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10mL漂洗3遍。

在软骨的提取过程中首先必须在无菌的条件下打开关节削取软骨，我们总会最大量的削取更多的软骨使得提取更多软骨细胞，但更要主要的是①避免削取软骨以外的组织，避免细胞提取还有其他组织细胞；②削取软骨时不要削的太厚，可以一层层的削，这样可以有助于软骨的消化；③削取完后软骨组织必须剪成1m3小块，有助于软骨的消化，用缓冲液多清洗几遍更好地去除血液、脂肪组织等其他组织。

2软骨的消化

用0.25%胰蛋白酶先消化30～35min，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10mL漂洗3遍；加入0.2%Ⅱ型胶原酶（DMEM配制），置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养消化100min，每30min置37℃恒温振荡箱振荡5min。后抽取上清液用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800r/min离心4min弃上清，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗两遍每次800r/min离心4min弃上清去除胶原酶。加入含12%胎牛血清DMEM3mL。用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。将软骨细胞按1×105/L浓度接种于10mL培养皿中，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。培养皿中剩余的软骨加入1%Ⅱ型胶原酶（DMEM配制）置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养消化，每1h置37℃恒温振荡箱振荡5min。倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800r/min离心4min弃上清，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗2遍800r/min/次，离心4min弃上清去除胶原酶。加入含12%胎牛血清DMEM3mL。用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。将软骨细胞按1×105/L浓度接种于10mL培养皿中，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁达到85%～90%后传代。

很多文献中软骨细胞消化都在3～6h，然而软骨细胞的消化时间要大大缩短，这也是兔膝骨关节炎模型的一个弊端，因为兔子的软骨细胞消化时间过长越长细胞损伤越厉害，虽然有时我们在细胞计数时看到的都是活细胞，但放到培养瓶里样上两天基本上没有贴壁的，软骨细胞也是一种群居生活的物种，贴壁细胞越少增值能力越低。

3细胞的传代及培养

软骨细胞培养方法很多，包括单层培养法、三维培养法、离心管培养法、生物反应器等。其中单层培养法、三维培养法用的比较多，因三维培养法需要付出昂贵的费用本实验采用单层培养法来培养兔膝骨关节炎软骨细胞。软骨细胞呈贴壁生长后，随传代次数增加，软骨细胞发生去分化现象，限制了软骨细胞的大量扩增。其中应该注意的是提取软骨细胞时应用含12%～13%FBS培养基进行培养，从第二代细胞开始改用含10%FBS培养基进行培养，每3d换液1次，细胞融合并覆盖瓶底>80%时，用0.25%胰蛋白酶﹙含0.02%EDTA﹚消化，进行传代培养。主要是因为开始时用含12%～13%FBS培养基进行培养是因为可以使细胞更容易贴壁，而后改为含10%FBS培养基进行培养是为了防止细胞早期就会出现"去分化"现象。实验一般选用第三第四代细胞，其活性与增值能力最强。

细胞传代时应注意的是胰蛋白酶消化时间不要过程，室温一般30～60s或用0.1%的胰蛋白酶。尽可能的减少细胞的损失。细胞离心600转5min，用枪吹打细胞时用力不要过猛。传代后细胞损伤严重时主要表现是细胞增值能力下降或出现"去分化"现象，细胞的"去分化"现象主要表现在细胞的形态与分泌，细胞从多呈三角形、长梭形或多角形向圆形改变，分泌的Ⅱ型胶原以及蛋白多糖减少。

5细胞的鉴定

5.1软骨细胞形态学观察在倒置显微镜下观察，刚接种的软骨细胞呈球形，24～48h后开始贴壁生长，细胞多呈三角形、长梭形或多角形，72h后细胞开始增殖，单层生长，彼此不相接触。细胞增长至爬满瓶底时软骨细胞可变为圆形，胞体丰满，胞浆均匀，核大而圆并且互相连接成"铺路石"样结构。苏木精-伊红染色苏木精-伊红染色可见软骨细胞呈三角形或多角形，细胞核呈紫蓝色，可见明显的双核仁或多核仁形态，细胞基质红染，胞浆及细胞周围有紫红色或红色异染出现[3]。

5.2Ⅱ型胶原蛋白Ⅱ型胶原的合成和分泌是软骨细胞维持其分化表型的特征性指标，可通过Ⅱ型胶原免疫荧光染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色来鉴定。Ⅱ型胶原免疫荧光染色﹙异硫氰酸荧光素FITC﹚可见胞浆和胞膜呈清晰绿色荧光，细胞核区域未见明显绿色荧光，证明软骨细胞特征性Ⅱ型胶原主要分布在胞浆和细胞膜上。Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现[4]。

5.3蛋白聚糖蛋白聚糖是软骨细胞分泌的基质成分，是软骨细胞功能的主要指标，可通过甲苯胺兰染色和阿利新蓝﹙Alcianblue﹚染色进行鉴定。甲苯胺兰染色可见软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，软骨细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒；阿利新蓝染色可见软骨细胞胞浆和胞膜呈深蓝色，证明培养软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖[5]。

5.4IL-1，TNF-α、MMP-13在细胞内以及分泌表达在ELRSA试剂盒。

6展望

软骨是一种特殊类型的结缔组织，由软骨细胞、软骨基质和纤维构成。软骨细胞的功能为合成细胞外基质大分子及各种酶类，而软骨细胞外基质主要有胶原和蛋白多糖聚集体组成。胶原中有间质型胶原I、Ⅱ和Ⅲ，且Ⅱ型胶原为软骨细胞的基因表达产物可用来确定软骨细胞的表型[6]。

1965年Chesterman和Smith首次利用体外培养的软骨细胞修复松质骨和关节软骨缺损，近30年来软骨细胞体外培养在方法学上也取得了很大进展[7]。软骨细胞经过培养所形成的结节样结构，具有关节软骨的生物学特征。软骨细胞体外培养的方法是从细胞水平来探索关节软骨生物学特性，为研究关节软骨疾病的发病原理及其治疗方法（包括药物治疗）提供了有效而简便的方法。以细胞体外培养技术为基础，在体外将软骨细胞进行定向诱导分化，调节细胞的增殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治疗某些退行性疾病的药物，因此具有广阔的应用前景。

因骨性关节炎软骨细胞处于退变期，细胞周期较正常软骨细胞周期要短，其可能原因：骨性关节炎软骨细胞为变性软骨细胞，细胞功能的改变可能影响细胞周期的变化[8]。损伤的骨性关节炎软骨中，软骨细胞代谢活跃，相伴随的细胞分泌的各种胞外基质也相应高表达，软骨代谢的异常，导致胞外基质成分的异常，软骨细胞生存环境改变促使软骨细胞过早的死亡，加剧骨性关节炎的进程；骨性关节炎软骨细胞中混杂有纤维软骨细胞，纤维软骨细胞增殖速度明显较软骨细胞快，必将影响细胞周期的变化[9-10]。

体外培养软骨细胞是研究软骨分化、增殖以及软骨病变的一种常用模型，也是软骨组织工程的基础。目前体外软骨细胞的培养技术已经日渐成熟，可从许多动物及人的不同软骨组织中分离培养软骨细胞，但是软骨细胞的体外培养方法均存在一定的局限性，培养条件还有待进一步完善。另外，软骨细胞分化、增殖过程中受到多种调控因子的调控，其相互作用机制复杂，对软骨细胞体外培养的影响还有待进一步的深入研究。

参考文献：

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[2]ManningWK，BonnerWM.Isolationandcultureofchondrocytesfromhumanarticularcartilage[J].ArthritisRheum，1967，10（3）：235-259.

[3]TewSR，PeffersMJ，McKayTR，etal.HyperosmolarityregulatesSOX9mRNAposttranscriptionallyinhumanarticularchondrocytes[J].AmJPhysiolCellPhysiol.2009，297（4）：898-906.

[4]QusousA，ParkerE，GeewanC，KapasiA，etal.Novelmethodsforthequantificationofchangesinactinorganizationinchondrocytesusingfluorescentimagingandlinearprofiling[J].MicroscResTech.2012，75（7）：991-999.

[5]StummM，BogerE，GaissmaierCG，etal.Genomicchondrocytecultureprofilingbyarray-CGH，interphase-FISHandRT-PCR[J].OsteoarthritisCartilage.2012，20（9）：1039-45.

[6]Gr？sselS，RickertM，OpolkaA，etal.CoculturebetweenperiostealexplantsandarticularchondrocytesinducesexpressionofTGF-beta1andcollagenI[J].Rheumatology（Oxford）.2010，49（2）：218-230.

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[8]MusumeciG，LoretoC，CarnazzaML，etal.OAcartilagederivedchondrocytesencapsulatedinpoly（ethyleneglycol）diacrylate（PEGDA）fortheevaluationofcartilagerestorationandapoptosisinaninvitromodel[J].HistolHistopathol.2011，26（10）：1265-1278.