化学冻伤处理方法篇1

【关键词】熊胆冻干粉针剂，；，，安全性实验，，

摘要：目的对熊胆冻干粉针剂进行肌肉刺激性、血管刺激性、全身过敏性及溶血性实验，以评价其用药的安全性。方法在肌肉刺激性实验中，主要观察2只家兔注射熊胆冻干粉针剂后48h的变化。在血管刺激性实验中，主要观察2只家兔分别连续5d注射熊胆冻干粉针剂及生理盐水的变化。在全身过敏性实验中，6只豚鼠隔日3次腹腔注射熊胆冻干粉针剂，于首次给药后第14日和21日分别静脉注射熊胆冻干粉针剂，观察15min内动物的变化。在溶血性实验中，观察本品在4h内有无溶血和聚集现象。结果熊胆冻干粉针剂对家兔股四头肌无刺激作用，对家兔耳缘静脉无刺激作用，对豚鼠未见过敏反应，家兔无溶血现象。结论熊胆冻干粉针剂的动物实验结果表明其安全可靠。

关键词：熊胆冻干粉针剂；安全性实验

TheTestReportoftheReliabilityofBearGallLyophilizedPowderforInjection

Abstract：ObjectiveToevaluatethereliabilityofbeargalllyophilizedpowderinjectionbytestingthemusclestimulation，vesselstimulation，hypersensitivityoftotalbobyandhaemolytictest.MethodsInthemusclestimulationtest，tworabbitswereobservedat48hafterinjectionbeargalllyophilizedpowder;Inthevesselstimulation，tworabbitswereobservedonthe5dafterinjectionbeargalllyophilizedpowderorsaline，respectively;Inhypersensitivityoftotalboby，6cavieswereinjectedbybeargalllyophilizedpowderinabdominalcavityin3times，andthelasttwowere14dand21dafterfirstmedication;Inthehaemolytictest，hemolysisandcoagulationweremainlyobserved.ResultsThebeargalllyophilizedpowderhasnostimulationtomuscleandearveinofrabbit，therabbitshavenoallergicreactionascontrastandwithouthemolyticreaction.ConclusionBeargalllyophilizedpowderinjectionissafeandreliablebasedontheanimalexperiment.

Keywords：BeargalllyophilizedpowderforInjection;Reliabilitytest

熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆，气微清香或微腥，味极苦而回甜，具有清热、镇惊、利胆等药理作用。引流熊胆和天然熊胆一样，主要含有胆酸，熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸。熊胆注射剂以引流熊胆为原料而制成的冻干粉针剂，其主要成分是熊去氧胆酸。为探讨熊胆冻干粉针剂的临床用药安全，我们对熊胆冻干粉针剂进行了安全性实验，现将实验内容及结果报道如下。

1药物

熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院天然药物教研室提供，临用时取本品。

2方法

2.1局部刺激性实验

2.1.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对家兔股四头肌的刺激性反应。

2.1.2动物日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0~2.5kg，由延边大学医学院实验动物科提供。

2.1.3方法取健康无损伤的家兔2只，以无菌操作法分别在其左右两腿股四头肌内各注入供试品1.0ml/只，注射后48h处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位局部刺激反应，按表1换算成相应的反应级。

2.1.4结果实验结果表明：两只家兔经肌肉注射后，家兔健康正常，腿部活动正常。家兔处死取出股四头肌后，肉眼观察给药部位，给予熊胆冻干粉针剂的4例股四头肌刺激反应级数各为0级，提示本品对家兔股四头肌无刺激作用。

2.2血管刺激性实验

2.2.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对家兔血管的刺激性反应。

2.2.2动物日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5kg，由延边大学医学院实验动物科提供。

表1注射肌肉刺激反应评级标准（略）

2.2.3方法取健康、两耳无损伤的家兔2只。用无菌操作方法于左耳耳缘静脉注射灭菌生理盐水2.3ml/kg，于右耳耳缘静脉注射熊胆冻干粉针剂的浓缩液2.3ml/kg，1次/d，连续3d。于末次注射24h后将动物放血处死，分别距注射部位进针点2cm处向心端剪下耳缘约2cm作为标本，标本用福尔马林固定，常规组织切片，观察血管周围变化、血管壁是否损伤、内皮细胞有无脱落、有无血栓形成以及其他病理变化。

2.2.4结果实验结果表明：家兔左右耳肉眼观察注射部位均无异常，血管无充血，周围组织无水肿现象。病理切片观察结果表明，给予生理盐水的2例耳缘和给予熊胆冻干粉针剂的4例耳缘均未见血管扩张和炎细胞浸润，提示本品对家兔血管无刺激作用。

2.3过敏实验

2.3.1目的本实验主要观察熊胆冻干粉针剂对豚鼠有无全身过敏性反应。

2.3.2动物健康无伤豚鼠，雄性，由延边大学医学院实验动物科提供。

2.3.3方法取健康无伤豚鼠6只，体重250～350g，隔日腹腔注射供试品0.5ml，连续3次，然后分为2组，每组3只，分别在第1次注射后14d及21d静脉注射本品1ml进行攻击，在注射后15min内观察动物反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或有音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者为阳性。

2.3.4结果实验结果表明：熊胆冻干粉针剂于第1次腹腔注射后第14天和第21天进行攻击，均未发生过敏反应。表明在本次实验条件下，熊胆冻干粉针剂对豚鼠无全身性致敏作用。结果见表2。

表2不同时间过敏实验观察结果（略）

“-”表示为阴性结果；“+”表示为阳性结果

2.4溶血性实验

2.4.1目的本实验观察熊胆冻干粉针剂有无溶血性反应。

2.4.2动物日本大耳白家兔，雄性，体重2.3kg，由延边大学医学院实验动物科提供。

2.4.3方法取健康家兔1只，从颈总动脉取血约10ml，放置于200ml三角瓶中，用玻璃棒搅动血液10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心（2000r/min，5min）除去上清液，沉淀的红血球再用生理盐水按如法洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。取沉淀的红细胞1ml，加生理盐水50ml，制得2%的兔红细胞混悬液。取试管7支，按表3配比量依次加入2%兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温水浴箱30min，然后分别加入不同量的上述药液（第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管），摇匀，置37℃恒温水浴箱中。开始每隔15min观察1次，1h后，观察1次/h，共4次。结果见表3。

表3溶血实验配比量（略）

2.4.4溶血判定标准溶液澄明红色，管底无细胞残留，为全溶血；溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留，为部分溶血；红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，为无溶血；虽无溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不分散为凝集。

2.4.5结果熊胆冻干粉针剂提取物无溶血和凝集反应，结果见表4。

表4各种时段溶血实验结果观察（略）

"-"表示无溶血或凝集反应，"+"表示有溶血或凝集反应

3结论

化学冻伤处理方法篇2

关键词：激光；透明带穿孔；透明带削薄；冻融小鼠卵子；受精率

TheEffectsofLaserZonaDrillingandLaserZonaPellucidaThinningontheFertilizationRatesofMouseVitrified-thawedOocytes

RAOJin-peng，QIUFeng，QIANXiao-hong，CAIYi-ting

（ReproductiveMedicineCenter，TheSecondAffiliatedHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine，Hangzhou310052，Zhejiang，China）

Abstract：ObjectiveToevaluatetheeffectsoflaserzonadrillingandlaserzonapellucidathinningonthefertilizationratesofmousevitrified-thawedoocytes.MethodsTheKunmingmousevitrified-thawedoocytesweredividedintofourgroups：thefirstthreegroupswereoccyteswithoutcumulus（DO），buttheforthgroupwereoocyteswithcumulus（COC）.AmongthethreeDOgroups，thefirstoneweretreatedbylaserzonadrillingandthesecondoneweretreatedbylaserzonapellucidathinning，however，thethirdDOgroupandtheCOCgroupwerenottreatedbylasershooting.Alltheoocyteswithorwithoutcumuluswerefertilizedinvitroatthesametime，andthefertilizationratewerecomparedonthenextday.ResultsThefertilizationratesoffourgroupswere52.1%（25/48），25.0%（12/48），21.3%（10/47）and17.0%（8/47）respectively.Thelaserzonadrillinggroup'sratesweresignificantlyhigherthantheotherthreegroups'（P0.05）.ConclusionThemethodsoflaserzonadrillingcouldimprovethefertilizationratesofmousevitrified-thawedoocytes.However，thelaserzonapellucidathinningmethodseemscouldreducethedamagecausedbylaser，butcouldnotovercometheproblemsofzonapellucidahardeningandglycoproteinhurtingduringvitrification，andcouldnotimprovefertilizationrates.

Keywords：Laser；Zonadrilling；Zonapellucidathinning；Mousevitrified-thawedoocytes；Fertilizationrates

激光破膜o助孵化（Laserassistedhatching）因具有精确，快速，便捷，安全的特点，近年来已经在辅助生殖技术（Assistedreproductivetechnology，ART）中广泛应用，对因胚胎冷冻造成的透明带变硬、反复着床失败患者的作用已经得到了普遍认可[1-3]。而人类卵子玻璃化冷冻技术因在生育力保存上具有重大的意义而成为近年来研究的热点。但有研究表明卵母细胞在培养过程中，不理想的体外条件会导致透明带变硬，而玻璃化冻融过程中温度的急剧变化则使得透明带硬化的现象进一步加剧，且冻融造成透明带糖蛋白损伤，使顶体反应进行困难，最终致使无法穿透透明带而受精失败[4]。本研究将激光破膜法运用到冻融小鼠卵子上，探讨激光透明带穿孔和激光透明带削薄两种方法对冻融卵子复苏后受精率的影响，为辅助生殖技术提供新的思路。

1资料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物6w龄雌性昆明系小白鼠（体重25～30g），10w龄以上成熟雄性昆明系小白鼠（体重30～35g），购自浙江中医药大学实验动物中心（动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2药物与试剂尿促性腺激素（HMG）与绒毛膜促性腺激素（HCG）均购自丽珠制药厂，透明质酸酶（hyaluronidas）及配子处理液G-GAMETE和G-IVF购自Vitrolife公司，卵子玻璃化冻融试剂盒购自Origio公司，石蜡油购自SAGE公司。

1.1.3耗材与设备四孔皿购自NUNC公司，60mm培养皿及巴斯德管购自FALCON公司，装载工具CRYOTOP购自KITAZATO公司。激光破膜仪为德国CTAX，超净工作台为丹麦IVFTECH，解剖显微镜为日本OLYMPUS，培养箱为美国THEMRO，液氮罐为美国MVE。

1.2方法

1.2.1冻融前小鼠卵母细胞的准备雌鼠腹腔注射10IU的HMG，48h后再注射10IU的HCG，15h后将小鼠颈椎脱臼处死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子处理液中刺破输卵管膨大部，挤出成簇卵冠丘复合物（cumulus-oocytecomplexes，COCs）。置于37℃培养箱2h后，留1/4数量的COCs待用，剩余3/4的COCs放入含透明质酸酶（hyaluronidas）的四孔皿内1min，再移入剩余3孔的GAMETE中反复吹打至w粒细胞剥离干净，选取形态良好MII期卵母细胞于G-IVF培养液37℃、6%CO2饱和湿度培养箱内培养30min待用。

1.2.2卵母细胞玻璃化冷冻复苏冷冻：采用EmbryoVitriSystem-Cooling试剂盒（Origio公司），冷冻液分为BS（basesolution，mHTF+12mg/mLHSA）、ES（equilibrationsolution，7.5%（v/v）DMSO+7.5%（v/v）EG）和VS（vitrificationsolution，15%（v/v）DMSO+15%（v/v）EG+0.58M蔗糖）。冷冻前将BS，ES和VS置于室温环境下平衡30min以上，分别将卵子转入BS（1min），ES（4～10min）和VS（40s）。然后将卵子以最小液滴体积2-3个/滴转移至KITAZATO载体片上，迅速置入液氮中，封上套管，标记保存。解冻：采用EmbryoVitriSystem-Warming试剂盒（Origio公司），解冻液分为WS1（warmingsolution1，1M蔗糖）、WS2（warmingsolution2，0.5M蔗糖）、WS3（warmingsolution3，0.25M蔗糖）、WS4（warmingsolution1，mHTF+12mg/mlHSA）。使用前，WS1在37℃平衡30min，其他解冻液室温平衡半小时以上。将KITAZATO载体从液氮中取出，迅速将前端载体片浸入WS1中，轻轻摇晃时卵子脱落到WS1中1min后，将卵子转移至WS2、WS3和WS4各3min，再转移至覆盖石蜡油的G-IVF微滴培养液（Vitrolife）中，并放入37℃、6%CO2饱和湿度培养箱继续培养。

1.2.3激光透明带穿孔或削薄穿孔：使用德国CTAX激光破膜仪，将含卵子的微滴皿移至载物台上，先于低倍镜下找到待处理的卵子，再将物镜切换至专用激光物镜上，点击激光解锁键，调节激光发射能量为2～3ms，将激光瞄准十字标定位到透明带待穿孔区域，依次点击激光发射键6～8次，直至透明带某一区域完全穿透，激光射击的位点应尽量远离极体，且保证仅作用在透明带上，不误伤卵子实体。削薄：在激光定位到透明带待削薄区域后，同样将能量调节至2～3ms，用激光将1/6周长的透明带削薄，而削薄透明带的厚度控制在50%～80%，且使得激光不完全穿透透明带。

1.2.4体外受精培养冷冻复苏后的卵子（经激光处理和未经激光处理）都需在体外进行继续培养1.5h，与此同时，处死雄鼠，剪取输精管及附睾尾取出，放入装有G-IVF的EP管中使其上游获能1h。选取形态正常的卵母细胞（大小正常，折光度好，且没有明显的胞浆溢出与皱缩）进行体外受精，调节加入的浓度，使得每个卵子周围有2～3万条，然后移至37℃、6%CO2饱和湿度培养箱培养4h后换液，继续培养过夜。

1.2.5结果统计受精后16～24h在倒置显微镜下观察受精和卵裂情况，受精率=2细胞及发育较快的3～4细胞的数量/总细胞数量。

1.3统计学方法采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用χ2检验，P

2结果

4组冻融卵子中，激光透明带穿孔组的复苏后受精率显著高于其余3组（P0.05），见表1。

3讨论

卵子在冻融过程中，温度的急剧变化、细胞膜内外渗透压的改变、结晶和重结晶的发生以及高浓度渗透性和非渗透性保护剂的毒性作用均会对卵母细胞造成损伤，影响其后续的受精和发育过程[5]。而冷冻过程中，超低温环境还会引起透明带糖蛋白基质的改变，导致透明带变硬，这些都将影响顶体反应的进行及随后的受精结局[6]。

本研究中，分别冻融了一批经透明质酸处理后脱去颗粒细胞的小鼠卵子以及带有颗粒细胞的卵子，而复苏后的受精率分别只有21.3%和17.0%，要远低于常规体外受精获得的受精率60%～80%，这一结果也验证了冻融确实对卵子产生损伤，造成受精困难。而当我们用激光破膜法对卵子透明带进行激光穿孔处理后，其冻融后的受精率获得了显著的提高（P

孙玲等[8]使用激光透明带穿孔和激光透明带削薄技术对受精后第3d的胚胎进行辅助孵化操作，发现穿孔组的妊娠率45.8%（44/96）和着床率25.2%（68/270）均要高于削薄组的40.7%（37/91）和24.8%（58/234），这似乎也提示激光穿孔的效果要优于激光削薄。但黄绮云[9]通过对冻融胚胎进行激光透明带穿孔和激光透明带薄化却得出了截然相反的结果，在其实验中，穿孔组的种植率及妊娠率均要低于薄化组。他认为当用激光将整个透明带穿透，热效应对卵裂球产生了极大伤害，而激光削薄处理与之相比则可以最大程度上避免这一损伤，获得更好的胚胎孵出结局。但是在激光辅助孵化中，透明带的削薄只是克服了孵化前的简单机械性阻力，减低孵化过程中所消耗的能量阈值，而精卵结合的受精过程却是一个非常复杂的生物分子化学反应过程，要克服的不只是物理上的阻力[10]。

刘丽均等[7]通过免疫荧光染色技术发现小鼠卵子冻融后透明带糖蛋白-2结构受到不同程度的损伤，而糖蛋白-2上存在着精卵结合的作用位点，它的受损使得无法结合到透明带上，也无法诱发其后的顶体反应，而顶体反应是穿过透明带的先决条件[10]。因此，激光透明带削薄处理虽然克服了部分透明带冻融变硬造成的机械阻力，但其不能修复冻融对糖蛋白造成的损伤，激光处理甚至进一步破坏了糖蛋白结构，最终使得无法识别透明带上的结合位点，而一旦不能与透明带结合，也就不能穿过最后一层透明带[10]。这也解释了本研究中用激光削薄处理透明带并未取得理想结果的原因。

综上所述，在应对卵子因冻融导致的受精困难的问题时，不建议采用激光透明带削薄的方法，而应控制好激光激发的强度和位置，完全将透明带某一区域穿透，如此才能有效提高冻融卵子受精率。

参考文献：

[1]ValojerdiMR，Eftekhari-YazdiP，KarimianL，etal.Effectoflaserzonapellucidaopeningonclinicaloutcomeofassistedreproductiontechnologyinpatientswithadvancedfemaleage，recurrentimplantationfailure，orfrozen-thawedembryos[J].FertilSteril，2008，90：84-91.

[2]CheckJH，HooverL，NazariA，etal.Theeffectofassistedhatchingonpregnancyratesafterfrozenembryotransfer[J].FertilSteril，1996，65：254-257.

[3]⒓，程东凯.激光辅助孵化对冻融胚胎种植潜力的影响[J].中外医疗，2012，10：23-25.

[4]WiningerJD，KortHI.Cryopreservationofimmatureandmaturehumanoocytes[J].SeminarsReprodMedi，2002，20：45-49.

[5]Yangl，FangY.N.WenJ.D.etal.Thetypeandextentofinjuriesinvitrifiedmouseoocytes[J].Cryobiology，2012，64：97-102.

[6]KoCS，DingDC，ChuTW，etal.Changestothemeioticspindleandzonapellucidaofmaturemouseoocytesfollowingdifferentcryopreservationmethods[J].AnimReprodSci.2008May；105（3-4）：272-282.

[7]刘丽均，郁丽丽，王俊风，等.激光打孔技术在小鼠卵子冷冻保存上的运用[J].中国比较医学杂志，2013，1：31-36.

[8]孙玲，陈士岭，李劲，等.两种不同激光辅助孵化方法对体外受精一胚胎移植妊娠结局的影响[J].广东医学，2007，28（5）：733-735.

化学冻伤处理方法篇3

[基金项目]国家自然科学基金项目（81674168）；四川省科学支撑项目（2011FZ0053）；四川省应用基础研究项目（2012JY0027）

[通信作者]*顾健，教授，研究生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，Tel：13882156288，E-mail：

[作者简介]张鑫，硕士研究生，E-mail：

[摘要]该文研究了波棱素（herpetin，HPT）脂质体冻干粉针剂的制备方法，并对其初步安全性和药效学进行评价。采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了HPT脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为（99.70±0.50）%，平均粒径为（107.0±1.2）nm，平均电位为（-6.11±0.72）；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；HPT脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）指标水平均明显改善，治疗效果明显优于HPT原药。按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高HPT的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。

[关键词]波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学

波棱素（herpetin，HPT）是从藏药波棱瓜HerpetospermumcaudigerumWall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。但HPT的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服HPT的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备HPT脂质体。本研究进一步对HPT脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了HPT脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。

1材料

Acquity型超高效液相色谱（美国，Waters）；ZS90激光粒度仪（英国，Malvern）；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱（上海一恒科学仪器有限公司）；可见分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）；台式高速离心机TGL-16G（无锡市瑞江分析仪器有限公司）。波棱素对照品（自制，纯度为98.59%）；波棱素原料药（自制，纯度>95%）；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超滤离心管（10kDa）购自Millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

ICR小鼠，SPF级，体重18～22g，雄性；家兔，体重1.8～2.2kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK（川）2013-24，SCXK（川）2013-14。

2方法与结果

2.1HPT脂质体溶液的制备

根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4mg、胆固醇195.1mg、大豆磷脂780.5mg，置于圆底烧瓶中，加入100mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F6850mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20min，过0.22μm滤膜，即得HPT脂质体溶液。经测定，HPT脂质体平均包封率（94.50±2.15）%，平均粒径（119.2±10.7）nm，多分散系数为0.156±0.075。

2.2冻干粉针处方筛选

选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于HPT脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得HPT脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，HPT脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为HPT脂质体的冻干保护剂。

2.3初步稳定性研究

取HPT脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40℃；②高湿试验条件：相对湿度（RH）75%；③光照试验条件：4500lx的光照。将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察HPT脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40℃条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。因此，HPT脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。

2.4溶血试验

取家兔血液10mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4000r・min-1离心5min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。样品管中分别加入适量HPT脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之HPT脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。混匀后，立即将试管置于37℃恒温水浴箱水浴30min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，HPT脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断HPT脂质体无溶血作用。

2.5全血凝血时间

取波棱素脂质体冻干粉针复水液10μL，以等量生理盐水作为对照，加入24孔细胞培养板中。另取枸橼酸葡萄糖抗凝家兔血适量，按体积比10∶1加入0.1mol・L-1CaCl2溶液进行活化，混匀，立即各取100μL加入上述含有样品的培养板中，分别于5，15，25，35，45，55min时间点加入3mL37℃预热的蒸馏水于对应的样品孔中。5min后取出适量样品液离心去除不溶物，于542nm下测定各样品光密度值。以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制全血凝固时间曲线，见图1，HPT脂质体冻干粉针复水液样品的全血动态凝血曲线与对照组相似，可知HPT脂质体对全血凝固时间无显著影响。

2.6血管刺激试验

取雄性家兔1只，每日右耳耳缘静脉注射HPT脂质体复水液20.0mg・kg-1，左耳耳缘静脉注射生理盐水注射液，作为空白对照组，每天1次，连续滴注4d。末次给药后24h，耳缘静脉注入空气处死家兔，剪取距注射部位1.3cm处兔耳，置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。光镜下观察药物对兔耳血管的刺激性反应，结果见图2，连续注射HPT脂质体后，耳缘静脉血管内皮完整，内皮细胞结构清楚，血管腔无扩张，无坏死脱落，未见明显炎细胞浸润，可判断HPT脂质体冻干粉针对血管无刺激性。

2.7HPT脂质体冻干粉针对四氯化碳致肝损伤的保护作用

2.7.1动物分组造模及给药ICR小鼠50只，雄性，18～22g。采用随机数字法将小鼠分成5组：正常组、模型组、HPT对照组、阳性对照组、治疗组，每组10只小鼠。HPT对照组尾静脉注射20mg・kg-1的HPT10%甘油生理盐水溶液（相当于0.4g・L-1的HPT）；阳性对照组尾静脉注射20mg・kg-1清开灵注射液；治疗组尾静脉注射20mL・kg-1的HPT脂质体原药溶液，正常组和模型组注射等体积生理盐水，均每天1次，连续给药7d。末次给药后1h，除空白组，其余各组腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液20mL・kg-1，造成急性肝损伤模型[4]。

2.7.2指标测定及评价腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液后，禁食不禁水16h后，摘眼球取血，血样室温静置30min，4℃4000r・min-1离心10min后，分离血清，备用。按试剂盒测定说明书分别测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活力，结果见表4。正常组小鼠血清中的AST，ALT，ALP活力明显低于模型组（P

3讨论

脂质体混悬液物理化学性质不稳定，不利于储存和运输，故制备成冻干粉针。制成冻干粉针的过程中，零下的温度会造成磷脂双分子层的破裂，加入的蔗糖和乳糖属于糖类大分子，能在脂质体混悬液中形成无形的骨架，能够起到冻干保护剂的作用，从而维持磷脂双分子的稳定。但受到本身原料的限制，冻干粉针也不能长时间处于高温、高湿和光照的环境。初步安全性实验结果表明，波棱素脂质体冻干粉针未造成家兔的溶血和凝血，对注射部位也没有明显的刺激反应。因此，所制备的波棱素脂质体冻干粉是安全可靠的，为今后可能的临床应用奠定了安全数据基础。

ALT，AST和ALP是自身免疫活性酶，主要存在于心肌、肝脏，血液中含量很低，当肝脏受到破坏时，才会在血液中急剧上升。CCl4致急性肝损伤是一种肝脏造模的经典方法，其原理在于CCl4其强氧化的自由基破坏肝脏细胞膜，从而导致其中的ALT，AST和ALP从肝脏流入血液。本实验结果表明HPT脂质体能较阳性组和HPT原药组，显著降低小鼠血清中ALT，AST和ALP水平，这表明其对肝损伤有明显的保护作用。这应该与脂质体制剂本身具有肝脏靶向性有关，能够富集HPT在肝脏部位，增强HPT清除强氧化自由基的效果。本研究为HPT脂质体保护急性肝损伤疾病提供实验依据，具有临床指导意义。

[参考文献]

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）.第1册[S].北京：中国医药科技出版社，1995：64.

[2]张鑫，谭睿，顾健，等.波棱素脂质体的制备工艺及处方优化研究[J].中国中药杂志，2014，39（6）：1007.

化学冻伤处理方法篇4

【摘要】目的探讨化学去细胞肌肉支架移植后对大鼠损伤脊髓轴突再生的促进作用。方法将24只成年雄性大鼠制成脊髓半横断损伤模型后，脊髓缺损处分别植入化学去细胞肌肉、冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉，空白组不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，对移植物中再生轴突进行计数，做统计学分析并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRP顺行和逆行示踪，1周后观察脊髓上行和下行轴突再生的情况。结果移植术后4周，空白组无脊髓再生轴突，化学去细胞肌肉中有大量再生的轴突，而冻融去细胞肌肉和新鲜肌肉中的再生轴突很少。锇酸染色显示化学去细胞肌肉中的有髓神经纤维较少。HRP示踪证明化学去细胞支架再生的轴突来自于其上下两端的脊髓。结论化学去细胞肌肉支架可显著促进损伤脊髓的轴突再生。

【关键词】脊髓损伤；去细胞肌肉；移植；轴突再生

ABSTRACT:ObjectiveToevaluateeffectsofchemicallyextractedacellularmusclegraftinpromotingaxonalregenerationafterspinalcordhemisectioninadultrats.MethodsTotally24maleratsunderwentspinalcordlateralhemisection.Treatmentconsistedofapplicationofchemicallyextractedacellularmusclegraft(CEAM)，freezethawedacellularmusclegraft(FAM)，orfreshmusclegraft(FM)intothelesiongap，whichwasleftemptyinlesiongroup(L).Ratsineachgroupwerekilled4weeksafterinductionoftheinjury.Holmessilverstainingmethodwasperformedtodetectaxonalregeneration.Axonsinthegraftsofeachgroupwerequantified，andtheresultswereanalyzedstatistically.MyelinatednervefibersinCEAMwereshownbyosmicationstaining.InanothersetofsixratstreatedwithCEAM，regenerationofdescendingandascendingspinalfibersoneweekaftertransplantationwasdeterminedbyanterogradeandretrogradeHRPlabeling.ResultsInallthenonimplantedanimals，nodefiniteaxonaloutgrowthintothelesionwasfound.ManyregeneratingaxonswerenotedtoextendintotheCEAMimplantedlesion，whilethenumberofregeneratingaxonsintheFAMorFMwasgreatlyreduced.However，myelinatednervefibersinCEAMwererelativelyfew.HRPtracingdemonstratedthattheCEAMgraftscouldpromotetheregenerationofdescendingandascendingaxonsinspinalcord.ConclusionCEAMcanpromoterobustregrowthofaxonsinspinalcord.

KEYWORDS:spinalcordinjury;acellularmuscle;transplantation;axongrowth

脊髓损伤后，常因局部的抑制环境导致神经轴突不能再生。研究表明，周围神经移植可促进脊髓损伤后的轴突再生[1]，但周围神经和脊髓直径大小的不同、供体来源有限等因素限制了外周神经作为移植体的应用。周围神经的基膜成分在促进神经纤维再生中起很重要的作用。骨骼肌因具有与神经相似的基膜结构，可作为神经的良好移植替代品[2]，但新鲜骨骼肌的移植可能会产生较强的免疫排斥反应。去细胞技术可去除骨骼肌细胞，有效消除骨骼肌作为移植体的抗原性，保留基膜成分，使这种移植成为可能。

去细胞肌肉组织工程支架按制作方法大体可分为2种：冻融去细胞肌肉组织工程支架(freezethawedacellularmusclegraft，FAMG)和化学去细胞肌肉组织工程支架(chemicallyextractedacellularmusclegraft，CEAMG)。已有文献报道冻融去细胞组织工程支架用于脊髓损伤治疗的研究，但效果不佳[3]，而化学去细胞肌肉组织工程支架对脊髓损伤的作用目前还不清楚。本实验利用化学去细胞方法去除骨骼肌的细胞成分，把化学去细胞骨骼肌支架移植入大鼠脊髓损伤处，观察化学去细胞肌肉促进脊髓轴突再生的效果，同时与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架进行比较。

1材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

1.2实验设计24只大鼠随机分成4组，制成脊髓半横断损伤模型后植入移植物或不做处理。A组，脊髓缺损处植入化学去细胞肌肉支架；B组，脊髓缺损处植入冻融去细胞肌肉支架；C组，脊髓缺损处植入从正常大鼠取出的新鲜肌肉；D组，空白组，脊髓缺损处不做处理。术后4周，银染观察脊髓轴突的再生情况，并用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维。另取6只化学去细胞肌肉治疗的模型鼠分别行HRP顺行和逆行示踪以观察再生轴突的来源。

1.3化学去细胞肌肉支架的制备参考BROWN等[4]去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架。简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50r/min摇48h后，转入30mL/L的TritonX100溶液，摇床中37℃、50r/min摇48h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃50r/min摇48h。换成10g/L的SDS溶液，摇床37℃，50r/min摇48h。PBS洗24h。PBS中4℃保存备用。取部分支架纵切面冰冻切片，HE染色观察细胞是否去除干净。

1.4冻融去细胞肌肉支架的制备取Wistar大鼠椎旁肌。按下述程序处理：在30g/L的NaCl溶液中浸泡10min，放入液氮至温度平衡；在蒸馏水中浸泡融化复温，再放入液氮中至温度平衡后取出，在等渗盐水中融化复温，反复3次。轻轻挤压肌条，漂洗，PBS中4℃保存备用。纵切面切片，HE染色观察支架的组织结构。

1.5脊髓半横断损伤模型的制备及生物支架移植成年雄性Wistar大鼠，用100g/L水合氯醛麻醉，取背后正中切口，剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露椎骨，行椎板切除术，暴露T10的脊髓，用虹膜剪的一侧在脊髓正中垂直插入直到透过脊髓，然后用剪刀剪下一段2mm的右半侧脊髓，于缺口处植入移植物，在移植物上方压一硅胶片以固定移植物，空白组损伤处不做任何处理，之后逐层封闭伤口。术后应用抗生素1周。

1.6Holmes镀银染色法显示脊髓移植区轴突再生情况术后4周，将模型鼠用100g/L水合氯醛麻醉，40g/L的多聚甲醛心脏灌流固定。取出含移植物部分或损伤处的脊髓，40g/L多聚甲醛4℃浸润固定，梯度蔗糖脱水，OCT冷冻包埋。恒冷箱切片机以冠状面切片，16μm厚。按Holmes镀银染色法染色显示再生的轴突。

1.7锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的有髓神经纤维取A组切片，入10g/L火棉胶液1min，取出至微干，再入800mL/L乙醇硬化1～2min，充分水洗。滴加10g/L锇酸水溶液足量覆盖切片，放在有盖暗湿盒内，置微波5档3min，取出后复温至室温，蒸馏水洗3次；梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。

1.8HRP示踪鉴定化学去细胞肌肉支架中的再生轴突的来源为进一步验证化学去细胞支架中再生的轴突是否来源于脊髓，另采用6只模型鼠移植入化学去细胞肌肉支架后，分2组分别进行HRP顺行和逆行示踪。具体过程如下，用上述方法制备脊髓损伤模型后，移植化学去细胞支架，然后分别在移植处上方或下方0.5cm处用微量注射器注入300g/L的HRP2μL。7d后按1.6方法取材，冰冻切片，DAB显色，蒸馏水洗，梯度乙醇脱水、透明、树胶封固。

1.9图像处理与统计学分析按STOKOLS等[5]的方法，每只动物随机取2张切片，400倍镜下观察，从移植物头端、中部及尾端三个区域内各取两点，对移植物中的再生轴突计数并求和，作为这张切片的再生轴突数，两张切片的再生轴突数求平均值作为此动物的再生轴突数，每组6只动物间取平均值作为该组再生轴突数量值，实验结果以±s表示。各治疗组再生轴突数量采用SSPS11.5统计软件处理，各组均数的比较采用单因素方差分析(OnewayANOVA)，有显著差异的组间分别采用t检验进行进一步验证。P

2结

果

2.1化学与冻融去细胞肌肉支架的组织结构HE染色观察可见化学去细胞肌肉支架中骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道(图1)。冻融去细胞肌肉支架切片中可见骨骼肌细胞成分依然存在，但是肌细胞完整性受到破坏，细胞横纹消失，肌细胞间出现与骨骼肌长轴平行的空隙(图2)。

2.2化学去细胞肌肉支架有效促进了损伤脊髓的轴突再生移植术后4周，A组切片可见移植物中有大量宿主细胞，银染显示有大量轴突(613.17±154.96)成束长入移植物。再生的轴突规则排列相互平行并与移植物和脊髓长轴平行(图3)。B组切片可见移植物支架中有少量宿主细胞，也有与移植物长轴平行的再生轴突(44.42±5.77)长入支架，但数量明显少于A组(P

2.3化学去细胞肌肉支架中再生的有髓神经纤维鉴定锇酸染色显示A组移植物中有少量的有髓神经纤维。有髓神经纤维的数量明显少于银染结果中的再生轴突的数量(图7)。

2.4化学去细胞肌肉支架中再生轴突的来源化学去细胞肌肉支架移植后1周HRP顺行和逆行示踪结果显示移植物中有HRP阳性轴突分布，这表明损伤脊髓的头端和尾端的轴突均可长入化学去细胞肌肉支架中(图8、图9)。

3讨

论

去细胞肌肉应用在脊髓损伤的治疗有诸多优点。首先，同其他移植物类似，去细胞肌肉移植代替了损伤脊髓组织对神经元轴突再生的抑制环境，而为脊髓神经纤维的再生提供了一个有利的环境；其次，骨骼肌的细胞外基质成分如层黏连蛋白(laminin)、Ⅳ型胶原(typeⅣcollagenproteins)等，可促进神经轴突再生，冻融去细胞肌肉可自然保留这些成分，而且这些成分也可以在化学去细胞后保留在支架中发挥促进神经轴突再生的作用[6]。肌纤维的排列结构与神经纤维类似，即使化学试剂完全去除细胞后，由细胞外基质形成的相互平行的管道样结构仍然保留，它们既提供了神经轴突可生长穿过的足够空间，又为再生神经轴突提供有方向的支持和引导，这对损伤脊髓的功能恢复具有重大意义。从本实验的结果看，三组移植物中都可见再生的轴突，这反映了细胞外基质对轴突再生的作用，而再生的轴突是有组织和有方向的，表明了去细胞肌肉支架作为神经组织工程支架而具有的天然优势。

本研究中发现化学去细胞肌肉支架与新鲜肌肉和冻融去细胞肌肉支架相比，可更好促进损伤脊髓的神经轴突再生。这说明化学去细胞肌肉支架除具有上述促进神经轴突再生的机制外，可能还包括其他更重要的因素。化学去细胞支架与其他两组支架的最大区别在于其细胞成分已完全去除，仅保留细胞外基质所构成的孔道结构，这样一方面会更好的暴露了层黏连蛋白、Ⅳ型胶原等有效成分，另一方面为轴突再生提供接触引导作用而促进其再生[7]，并不产生轴突再生的阻力。此外，这种结构特点使其具有良好的通透性，利于细胞成分快速进入。本研究观察到在损伤后3d化学去细胞肌肉支架中即可见到大量宿主细胞，在移植术后4周，可见化学去细胞肌肉支架中的宿主细胞成分明显多于其他两组，而脊髓损伤后再生的细胞成分有很多是对神经轴突再生有促进作用的，比如巨噬细胞[8]，实验中我们已观察到化学去细胞支架中有巨噬细胞(本文结果未显示)。进入到化学去细胞肌肉支架中的这些细胞成分可使脊髓中损伤和再生之间的动态平衡向再生方向移动，促进脊髓轴突长入支架。这些因素的存在可能导致了A组与其他两组移植物的巨大差异。

除轴突再生外，脊髓损伤修复的另一个重要方面就是髓鞘的修复。为此，本研究用锇酸染色鉴定化学去细胞肌肉支架中的髓鞘生成情况。结果显示，部分再生的神经轴突有髓鞘形成，但生成髓鞘的神经纤维很少，这可能是由于内源性少突胶质细胞的前体细胞不能充分增生和分化所导致的[9]。

脊髓组织工程支架中的再生神经轴突可以来自于脊髓，也可以来自于脊髓周围神经根[10]，而移植物能促进脊髓的神经轴突再生(而不是促进神经根所代表的周围神经的再生)，相对来说是更重要的，只有这样才有可能重建脊髓神经传导通路，恢复脊髓的功能。因此本实验用HRP示踪技术验证化学去细胞肌肉支架对脊髓上行和下行神经轴突再生的促进作用。HRP示踪结果显示化学去细胞支架移植后1周，支架中可见上行和下行的HRP阳性神经轴突，这与银染的结果一致。化学去细胞肌肉移植后1个月，可见移植物头尾两端均有神经轴突长入。这表明化学去细胞肌肉支架中的再生神经轴突来源于脊髓。

综上所述，化学去细胞肌肉支架可有效促进脊髓的神经轴突再生，而且再生的神经轴突是高度规则排列和有方向的。该支架有望成为一种神经组织工程材料，用于脊髓损伤的治疗。

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化学冻伤处理方法篇5

【摘要】目的探讨胡椒醇提液外用对兔耳轻度冻伤的治疗效果。方法用－15℃左右低温液复制兔耳轻度冻伤模型，冻伤后48h开始在兔冻耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治疗，2d后测定血清中sod活性、mda和tnf-α含量，4d后评价冻耳外观正常与否及变形程度，制作冻耳组织病理切片，显微镜下观察冻耳组织病理变化，同时测定血清与冻耳组织中sod活性、mda和tnf-α含量。结果用胡椒70%乙醇提取液治疗2d后血清中sod活性显著增加，mda量显著降低，tnf-α量无明显变化。治疗4d后血清中sod活性、mda和tnf-α含量均无明显差异，但冻耳组织中sod活性与tnf-α水平显著提高，mda量显著降低。另外冻耳外观评价与组织病理检查显示冻耳组织坏死范围减少，修复速度明显提高。结论胡椒70%乙醇提取液局部外用对轻度冻伤有治疗作用。

【关键词】胡椒；冻伤；治疗作用

abstract：objectivetoinvestigatethetherapeuticeffectofalcoholextractfrompepperonmildandmoderatefrostbiteofrabbitear.methodstherightrabbitear,within7cmscopefromapexconchaeauristowardsulcusauriculaeposterior,wasimmersedintocoldliquidat-15℃toestablishanexperimentalmodelofmildandmoderatefrostbite.2dafterfrostbite,70%alcoholextractfrompepperwasappliedontosurfaceofearsfrozen.sodactivity,mdaandtnf-αlevelsinserumweredetermined2and4daftertreatment.thenafterapplicationfor4d,sodactivity,contentsofmdaandtnf-αintissueofearfrozenweredetected.inaddition,therecoveryprofilesofearfrozenlikeappearancevariablesandhistopathologicfeaturesweresurveyed.resultssodactivityinserumsignificantlyincreased2daftertreatmentwith70%alcoholextractfrompepper,mdalevelsignificantlydecreasedandtnf-αlevelhadnodifference.sodactivity,mdaandtnf-αconcentrationsinserumshowednodifferencesafteradministrationfor4d.intissueoftheaffectedear,sodactivityandtnf-αcontentswereobviouslyathighlevelsatthistime,mdacontentwastheopposite.ontheotherhand,theappearancereviewandhistopathologicexaminationbothmanifestedthattopicalapplicationof70%alcoholextractfrompepperdiminishednecroticregionsofearfrozen,acceleratedtissuerepairafterfrostbite.conclusion70%alcoholextractofpepperhaspharmacologicalactivityonmildandmoderatefrostbitehealing.

keywords：pepper;frostbite;therapeuticeffect

胡椒是传统中药，为胡椒科植物胡椒pipernigruml.的干燥近成熟或成熟果实。民间有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患处治疗冻疮的用法，并且疗效确切。笔者所在研究组欲对胡椒抗冻疮作用进行动物实验验证，通过查阅中外文献数据库（包括中国cnki和vip科技论文全文数据库，美国gale、pubmed和highwirepress数据库），未能检索到动物冻疮实验模型的报道。研究组曾根据冻疮病因病机试制动物冻疮模型，但均未成功。临床上认为ⅰ，ⅱ度（轻度）冻伤和冻疮的临床表现及治疗基本一致，因此在没有冻疮动物模型可用的情况下，药物对轻度冻伤的疗效仍可作为对冻疮治疗作用的参考，有积极意义。

兔耳冻伤后由于局部细胞发生变性或坏死，兔耳形态和组织结构会有所改变，变性的细胞如及时恢复供血供氧，清除损伤因子，能转为正常，反之，如持续缺血缺氧，则损伤可进一步加重，直至坏死。坏死表皮可由周围正常表皮再生修复，真皮坏死则只能通过肉芽组织填补修复，修复后兔耳形态和组织结构不能恢复正常；另外，因冻伤后机体氧化抗氧化系统平衡被打破，丙二醛（mda）和超氧化物歧化酶（sod）这对反映组织氧化损伤程度与抗氧化能力的生化指标会发生相应变化；近年来肿瘤坏死因子α（tnf-α）在创伤和创伤修复中的作用越来越受人们关注。现已证实，在创伤修复早期tnf-α能诱导白细胞脱颗粒，增强其吞噬能力，加速肉芽组织及肉芽组织内新生血管形成［1～3］。在修复中、后期高浓度tnfα能抑制成纤维细胞胶原蛋白基因的转录,同时可以引起胶原酶基因转录的显著增加,因而tnfα在组织的重塑中具有重要意义，可减少瘢痕组织形成，提高修复质量［4，5］。也就是说，在创伤修复早期适当浓度的tnfα能加速创面修复，中、后期高浓度tnfα能提高修复质量［6］。该文通过观察冻伤兔耳治疗后外观形态与组织病理改变情况，测定血清和冻耳组织中mda、sod、tnf-α含量综合评价胡椒局部外用对兔耳轻度冻伤的治疗作用，进而研究胡椒抗冻疮的效果。

1仪器与材料

1.1仪器

2010型酶标仪（奥地利anthoslabtecinstruments公司）；756mc紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2试药

取白胡椒（购自东骏大药房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24h），合并浸提液，静置分层，过滤，滤液用70%乙醇配制为高、中两种浓度供试液，每毫升分别相当于生药3.30，1.65g；mda和sod试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20071228，20071227）；tnfα试剂盒（美国adlitteramdiagnosticlaboratories公司，批号：rt110371）。

1.3动物

日本大耳白兔40只，体质量2.0～3.0kg，雌雄兼用，由昆明医学院实验动物中心提供，合格证号：scxk（滇）2005-0008。

2方法

2.1冻伤模型复制与给药

［7］取家兔分为4组，即正常、溶剂和高、中浓度胡椒供试液组，每组10只，于实验室正常单笼饲养6d后将右耳耳尖至耳根7cm范围剪毛，隔日将右耳剪毛区域浸入（-15±1）℃冷冻液（6份碎冰+1份氯化钠）中，正常组除外。待兔耳变白变硬后再冻30s，取出，空气中停留20s后以35℃温水复温20s，取出兔耳，擦干水分，冻伤模型复制完毕。冻伤后48h开始在冻伤兔耳剪毛区域分别涂药，1ml/次，3次/d，涂药4d后，治疗结束。

2.2冻耳治疗后外观评价

冻耳皱缩变形的范围大小反映了组织细胞坏死和瘢痕修复的范围大小，是药物对冻伤所致组织细胞变性的保护和促恢复作用的直接体现。此处将冻耳治疗后外观评价由好到差分为4级：正常（冻耳治疗后颜色、外观、触感和厚度与正常兔耳完全一样）、轻度变形(冻耳耳尖至耳根方向2cm区域内皱缩变形)、中度变形(耳尖至耳根方向4cm区域内皱缩变形)、重度变形(耳尖至耳根方向皱缩变形范围超过4cm)。

2.3冻耳病理检查

治疗4d后，家兔左耳耳缘静脉空气栓塞致死，立即沿浸冻线剪下冻耳浸冻部分，由耳尖垂直于浸冻线方向将冻耳浸冻部分剪成对称的两半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做sod、mda和tnf-α测定），分别在耳尖向耳根方向1，2，3cm处取材，常规石蜡包埋，he染色，以正常兔耳为对照，显微镜下观察冻耳组织病理变化。

2.4sod、mda和tnfα测定

［8］涂药2d后，左耳中央动脉取血约4ml。涂药4d后心脏取血约4ml，取“2.3”项下病理检查剪下的另一半冻耳，剪取耳尖部，置事先盛有预冷生理盐水的小烧杯中，涮洗几下，取出，滤纸吸干水分，称1g耳尖部组织，用10ml预冷ph7.4的0.01mol/l的pbs制备组织匀浆。血液与组织匀浆4℃分别以4000r/min和2000r/min离心10min，取血清和耳组织匀浆上清，按试剂盒中操作方法测定sod总活力、mda与tnf-α含量。

2.5统计

所有数据均用spss13.0统计，其中冻耳治疗后外观评价用秩和检验mann-whitneyu法，sod、mda和tnfα测定结果用方差分析lsd法。

3结果

3.1冻耳外观变化

复温后兔耳开始发红发热，随后变紫、肿胀、下垂。肿胀逐渐加剧，12h后部分兔耳出现浆液性水泡，泡液无色或淡黄色，随后水泡增大或新水泡形成。24h后肿胀程度不再增加，水泡不再增大或无新水泡形成。48h后部分兔耳冻区有黄色液体渗出。治疗后冻耳肿胀逐渐消退，治疗结束（治疗4d）后各组冻耳均已不见明显肿胀。高、中浓度胡椒供试液组治疗结束后分别有4只和2只家兔冻耳外观同正常兔耳（冻耳表皮光滑平整，未见坏死，冻耳颜色、触感、弹性和厚度均与未冻伤的左耳完全一样），其它家兔冻耳均有不同程度的皱缩变形和硬化、表面凹凸不平、表皮坏死，个别家兔冻耳表面有硬痂产生。高浓度胡椒供试液组治疗结束后冻耳外观评价明显好于溶剂组（p<0.01）。结果见表1。表1胡椒对轻度冻伤兔耳形态改变的影响（略）

3.2冻耳治疗后病理变化

治疗后高、中浓度胡椒供试液组兔冻耳表皮均修复完整，真皮水肿及炎症均明显消退，部分兔冻耳真皮已无水肿和炎症表现（高浓度5只，低浓度3只），近半数兔冻耳毛囊和皮脂腺数量正常（高浓度6只，中浓度4只），未见毛囊和皮脂腺坏死，冻耳总体恢复程度和速度明显好于溶剂组，见图1。

3.3sod测定结果

治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中sod活力均显著高于溶剂组（p<0.01）。治疗4d后各组血清中sod活力已无明显差异，但冻耳组织中sod活力有明显不同，高、中浓度胡椒供试液组显著高于溶剂组（高浓度p<0.01，中浓度p<0.05）。结果见表2。表2胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中sod活力的影响（略）

3.4mda测定结果

治疗2d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中mda量显著低于溶剂组（p<0.01）。治疗4d后各组血清中mda量均一定程度下降，与正常组相比已无明显差异，但此时冻耳组织中mda量有差异，高、中浓度胡椒供试液组显著低于溶剂组（高浓度p<0.01，中浓度p<0.05）。结果见表3。表3胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中mda含量的影响（略）

3.5tnf-α测定结果

治疗2d和4d后，高、中浓度胡椒供试液组血清中tnf-α量与溶剂组相比均无明显差异，但治疗4d后冻耳组织中tnf-α量显著高于溶剂组（p<0.01）。结果见表4。表4胡椒对兔耳轻度冻伤后血清及冻耳组织中tnf-α含量的影响（略）

4讨论

兔耳冻伤后形态改变的范围实际上反映了冻耳存活的组织细胞面积和存活量。所以，治疗结束后，通过兔冻耳外观正常与否及形态异常范围可评价药物抗冻伤的疗效，药物如能减少耳冻伤后细胞坏死的数量和范围，则冻耳形态改变区域就小。此次研究结果显示，高浓度胡椒供试液能显著降低兔耳轻度冻伤后形态改变程度（p<0.01）,并且治疗结束后4/10冻耳形态与正常兔耳完全一致。

冻伤4d（治疗2d）后兔血循环中sod活力还明显低于正常，相应的脂质过氧化物mda含量明显高于正常，但胡椒供试液能显著增强血液中sod活力，减少mda的产生。冻伤6d（治疗4d）后血循环中sod活力和mda水平基本恢复正常，但冻耳组织中sod活力明显低于正常，另外mda量也明显高于正常，更有意义的是胡椒供试液能显著增加冻耳组织中sod活力并降低mda水平。由此说明，兔耳局部轻度（主要是ⅱ度）冻伤后不仅能打破受冻局部组织氧化抗氧化系统的平衡，并且因此可使全身血循环中氧化抗氧化系统受累，最终导致失衡。氧化抗氧化系统失衡的顺序为局部冻伤组织到全身血循环，而恢复的顺序则正好相反。另外实验结果也说明，冻伤局部应用胡椒70%乙醇提取液能有效增加机体抗氧化能力，抑制受冻组织氧化损伤。

兔冻耳局部胡椒供试液治疗2d和4d后血液中tnf-α水平与溶剂组相比均无明显差别，值得关注的是，治疗4d（冻伤6d）后冻耳组织中tnf-α含量显著高于溶剂组。前面已经述及在修复中、后期高浓度的tnf-α能促进组织重塑，提高修复质量，这与冻耳治疗后外观评价、组织病理及mda与sod活力测定结果相吻合。

兔足轻、重度冻伤后72h内sod活性和mda量的变化［9］、大鼠重度冻伤后72h内sod活性、mda和tnf-α含量的变化［10］国内已见报道，但冻伤后更长时间的上述指标的定量及变化还没有文献，加之冻伤后生化指标变化的研究报道数量很有限，所以药物抗冻伤的药效研究都未就冻伤后这些指标的变化进行测定。此次胡椒对兔耳轻度冻伤的作用研究中sod活性、mda和tnf-α含量变化测定结果对药物抗轻度冻伤和冻疮药效评价有一定参考价值。

【参考文献】

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化学冻伤处理方法篇6

1临床资料和方法

1.1一般资料:58例均为我科诊治的增生性患者,其中女32例,男26例,年龄2～12岁。瘢痕产生的原因:手术后瘢痕8例,外伤后瘢痕21例,烧烫伤后瘢痕26例,预防接种后瘢痕3例;皮损部位:胸前区8例,颈部9例,其次为背部、面部、四肢等处,共41例;皮损大小:直径4cm者4例。58例患儿均无其他临床疾病及传染病,3个月内未进行过任何治疗。采用随机对照法将58例患儿随机分为治疗组30例,对照组28例,两组在年龄、性别、瘢痕大小,皮损情况,病程长短等方面经统计学处理无显著性差异,具有可比性。

1.2治疗方法:治疗组:30例,采用冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射。首先用液氮冷冻治疗,用无菌棉签蘸取液氮后压迫于瘢痕之上,直至瘢痕颜色变白时停止冷冻(10～25s),冷冻时间与瘢痕的厚度呈正相关,即瘢痕越厚,压力越大,时间越长,反复数次(4～6个冻融循环),瘢痕较大者可分区分片进行冷冻。冷冻约30min后瘢痕表皮即有水疱,瘢痕组织四周会出现反应性血管充盈区,24h左右术区水疱渗出量达到高峰,可每天用碘伏涂擦水疱及周围皮肤,水疱较大者可用无菌针头放出渗液,保留表皮,可反复放液,无须包扎,注意保持局部清洁干燥,待逐渐干涸结痂并于10天后脱落,触摸瘢痕,如质地较软,可进行下一步注射治疗,如瘢痕较硬,可再次冷冻,直至瘢痕变软后再进行注射治疗。具体为:取苯海拉明20mg(河南新乡常乐制药有限公司生产),常规消毒瘢痕及周围皮肤,用1ml无菌注射器抽取药液行瘢痕内注射,针尖斜面应向上,注射至瘢痕刚发白为止,一次注射总量儿童不宜超过40mg,15～30min后观察有无过敏反应发生。1周注射1次,一般4次为一个疗程。

对照组:28例,单独采用液氮冷冻治疗,其方法同治疗组。

1.3疗效判断标准[1]:治愈:疼痛、瘙痒等症状消失,瘢痕完全软化变平、触之柔软,无硬结或条索状,治疗后12个月无复发;显效:疼痛、瘙痒等症状消失或基本消失,瘢痕中有60.0%～70.0%的部分软化变平,瘢痕由重变轻,治疗后12个月无复发;无效:疼痛、瘙痒等症状稍有减轻或无变化,瘢痕质地、大小仅有轻微变化或没有变化,治疗完成后12个月后又复发。总有效率以痊愈加显效计。

2结果

治疗组30例,治愈14例,总有效率93.3%;对照组28例,治愈9例,总有效率71.4%,两组总有效率比较差异有显著性(χ2=4.87,P

3讨论

瘢痕形成是创伤修复的一种必然结果,但过度修复会导致病理性瘢痕的形成,引起外形的毁损和程度不等的功能障碍。国内外对瘢痕的治疗有手术、药物、压力、激光、放射等多种疗法,但是复发率仍很高,有些方法并发症很多,不适合儿童。研究表明,单一疗法往往很难有效控制病理性瘢痕的发展,只有采取综合治疗,才可望在瘢痕防治上取得突破和显著疗效[2]。由于单一疗法的复发率较高,故多采用两种或两种以上方法联合治疗,如药物注射联合放射、药物治疗联合激光,以及外科手术后联合激光或药物治疗等[3-5],我科近两年采用冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射治疗儿童增生性瘢痕,效果良好。

液氮冷冻治疗增生性瘢痕是一种物理疗法,安全有效、无副作用,尤其适合儿童增生性瘢痕的治疗。它可通过超低温,导致细胞脱水,皱缩和活细胞萎缩,迅速使受冻细胞死亡,瘢痕因低温导致组织坏死,结痂脱落后明显变平、软化,自觉症状消失。冷冻的超低温还能使皮肤角质层与生长层松懈,胶原纤维变性从而抑制成纤维细胞生长。Dalkowski等[6]冷冻处理体外培养的瘢痕成纤维细胞,发现低温对细胞增殖无明显影响,而机械作用可使细胞产生致命性的破坏,Ⅲ型胶原的合成减少,Ⅱ/I型胶原的比率增加,同时成纤维细胞Tenascin-C减少,为冷冻治疗瘢痕提供了理论依据。冷冻治疗主要不良反应为水疱形成、伤口愈合延迟、色素脱失或色素沉着等。研究表明冻融时间大于25s通常会引起黑素细胞的破坏,继发色素减退,特别是Ⅳ～Ⅵ型皮肤的人,冻融时间在15～20s则不易引起色素减退,但需多次治疗[7]。冷冻治疗应严格掌握冻融时间和频率，避免不良反应发生。对面积较大的瘢痕需分区分片进行冷冻并配合药物注射综合治疗。

苯海拉明为抗组胺药物，有文献报道在瘢痕的成纤维细胞培养基中加入苯海拉明，发现它能有效抑制成纤维细胞的生长。此外，免疫学研究证明，瘢痕的发病机理中有免疫因素参与，苯海拉明能有效抑制此类免疫反应，从而起到治疗瘢痕及止痒作用。苯海拉明还有阻滞周围神经传导的作用，可以作为局部麻醉剂使用，减轻了药物注入瘢痕时导致的剧烈疼痛，无需在注射液中另加利多卡因，且副作用小，对不适合注射激素的儿童尤为适用，可以减少许多并发症。因瘢痕组织较为致密，单独注射药物阻力大、疼痛，患儿很难配合，先冷冻即可抑制成纤维细胞的生长，又可使瘢痕变薄变软，瘢痕变薄变软后再配合苯海拉明药物注射，缩短了治疗周期，减少了单独冷冻、单独药物注射引起的不良反应。

冷冻联合苯海拉明瘢痕内注射综合治疗儿童增生性瘢痕，设备简单，操作方便，安全性高，未发现有明显副作用。

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