病毒实验室篇1

天花病毒“死灰复燃”危机？

全球消灭了天花病毒之后，世界各地的一些实验室还保留了一些以研究为目的的天花病毒，用于研究流行性疾病的治疗方法和开发病毒疫苗等。然而在1978年，天花病毒开始出现死灰复燃的危险。伯明翰大学医学院的一位摄影师珍妮特・帕克，一开始感觉头痛和肌肉疼痛，多日后全身出现红点，医生诊断为无害皮疹。然而两个星期后，一些异常症状开始出现，医生再次诊断为天花。虽然她接受了隔离治疗，但两周后仍然不幸去世。她母亲也被感染，但最终活了下来。

帕克之所以被感染，有可能是楼下实验室里研究人员保存的天花病毒样本通过通风管道进入了她的办公室里。伯明翰大学医学微生物学部门的负责人亨利・贝德森为帕克的不幸深感内疚，在帕克去世几天前自杀。

这种令人沉痛的一系列事件的发生，引发了人们对保留天花病毒研究的重新思考。人们意识到，我们需要完全灭绝病毒，而不仅仅只是消灭这种疾病。这一事件让人们认识到保存在实验室试管中和小瓶子里的天花病毒样本是一个严重隐患。

世界卫生组织呼吁要求所有样本病毒，要么摧毁，要么送到两个存放地之一：美国亚特兰大的疾病预防控制中心实验室，或俄罗斯西伯利亚的国家病毒和生物技术研究中心。少量的样品很快从印度、日本、英国和其他地方被送过去。美国疾控中心根除天花计划负责人迈克尔・莱恩说：“显然，没有人希望病毒留在实验室里，他们毅然决然地放弃了这些东西。”

其他地方还有天花病毒吗？

那么，我们又如何知道其他地方还有没有天花病毒残余呢？例如，在的藏身之处是否藏有天花病毒样本？或者，在某个被遗忘的冷库里是否留有天花病毒小瓶子？莱恩说：“我们不知道，我们没有办法证明这些消息的可靠性。”

不过，看起来天花样本已被限制在美国疾控中心和俄罗斯西伯利亚的病毒研究中心了。因为据专家们所知，自20世纪70年代末以来再没有人感染天花，没有站出来声称他们拥有天花病毒，也没有关于天花病毒被保存在一些秘密实验室里的传言。

但是，1992年，叛逃到美国的一名曾任苏联生物战机构副主任的俄罗斯军官称，苏联制造了50吨天花病毒，并有3万人从事天花和其他致病病毒武器的研究制造工作，如埃博拉、炭疽病和瘟疫等。

有人认为，天花病毒被开发成生物武器和进行工业规模生产并非不可能。但其他一些人，包括莱恩在内，对那位俄罗斯军官的指称持怀疑态度。莱恩说：“我们没有充分理由相信这种制造紧张气氛、耸人听闻的消息。”

天花病毒的最终命运会如何？

美国和俄罗斯存留的天花病毒最终的命运将是被彻底消灭。

2014年夏，在世界卫生组织大会上投票表决是否要销毁剩下的天花病毒样本时，俄罗斯代表团投票反对。俄罗斯并不是唯一想保留天花病毒的国家。

一些科学家提出，对复杂的病毒基因做更多的研究，可有助于设计出更有效的抗病毒药物，病毒样本的存在至关重要。

持异议者认为，大部分病毒研究可以用毒性较小的牛痘病毒或其他相关病毒来做。他们担心，如果没有彻底销毁天花病毒，谁又能保证它不会落入坏人之手呢？事实上，即使病毒被彻底销毁，现有的实验室技术也有可能根据已被测序的天花基因组重建天花病毒。

病毒实验室篇2

关键词：巨细胞病毒感染IgM新生儿酶联免疫法【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1008-1879（2012）12-0166-02

新生儿巨细胞病毒感染是由巨细胞病毒（HCMV）引起的感染性疾病，新生儿感染的途径主要为先天性、围产期以及生后感染三种方式。巨细胞病毒属于疱疹病毒，感染后其发病隐匿，严重影响患者的预后及生活生存质量。在我国CMV感染率约3.7%，妊娠期孕妇的CMV感染率在4.3%-7%之间[1]。目前常用的检测有血清学检测CMV-IgM，及PCR检测CMV-DNA为主的病毒核酸检测等。本研究主要采用检测IgM抗体以比较患者治疗前后的疗效，现报道如下。

1一般资料与方法

入选患者为2011年12月到2012年10月本院门诊或住院患者68名。患者年龄为1-28天（10.9±3.69d），出生体重1490-4010（2895±582）g。患者相关情况如下：肝脏大43例，脾大1例，原始反射异常25例；听力筛查异常者21例，肝功能受损者12例，神经测定评分

1.1一般资料。

1.2诊断、纳入及排除标准。诊断标准：参考《巨细胞病毒感染诊断方案》[2]，①在受检的血或尿液中任何一种的病毒学检查中分离出CMV；②患儿外周血CMV-PP65阳性；③抗CMVIgG阳性；④结合临床。纳入标准：①患者家属签署知情同意书者；②符合诊断者。排除标准：①严重免疫缺陷者；②类风湿因子等干扰；③其他病因引起类似症状的感染疾病；④严重疾患急需治疗者。

1.3检验方法。

1.3.1患者IgM抗体检测采用：巨细胞病毒IgM抗体检测试剂盒，生产厂家为：北京现代高达生物生物技术有限责任公司。

1.3.2检测时间为患者经系统治疗前后。

1.3.3检测方法为：静脉采血，分离血清，存放于4℃，避免反复冻融及溶血。实验步骤及相关注意事项、实验结果解释等严格按照说明书操作；实验步骤包括：平衡、配液、设定、加样、加酶、温育、洗板、终止及测定。检测的实验原理为：以捕获法的原理检测血清中的CMVIgM抗体。其中包括：人IgM包被的微孔板、以HRP（即辣根过氧化物酶）标记的重组巨细胞病毒CMV抗原作为示踪剂，采用TMB显色系统。

1.3.4检验仪器为：酶标仪MindrayMR-96A、洗板机MindrayMW-12A。

1.4治疗方法。患者的治疗为促胆汁排泄、保肝及对症支持治疗等。[3]更昔洛韦：诱导阶段：更昔洛韦5mg/kg静脉滴注/次，12h/次，共2周；之后停药（更昔洛韦）1周；后给予维持治疗：5mg/kg静脉滴注/次，每次滴注的时间在1h以上，1次/日，5次/周，总疗程2个月。

1.5评价指标。

1.5.1疗效评价标准。患者临床症状体征改善或消失、实验室检查结果好转或痊愈，包括CMVIgM的阳性转阴，及转阴率。

1.5.2不良反应检测。诱导阶段时期，患者每周检测血常规2次，肝肾功1次；维持治疗期间，每周检测血常规1次，肝肾功1次/2周。

1.6统计学处理。采用SPSS13.0统计学软件，以处理数据，计量资料组间采用t检验，计数资料采用X2检验，P

2结果

2.1患者治疗前后实验室结果CMVIgM的转归。治疗前、后相比较，患者CMVIgM具有显著差异，（P

2.2治疗前后比较，患者症状体征及检查均较治疗前改善明显（P

2.3少数患者有贫血、皮疹、呕吐等不良反应，经对症治疗后，均减轻缓解。

3讨论

新生儿的CMV感染临床表现无显著的特异性，以肝损害常见，可表现为肝脏大、黄疸、肝功异常、咳嗽、贫血、血小板减少或增多、听力障碍等。而HCMV感染胎儿病死率可达10%-30%，而存活的病患中，大部分多种神经系统相关后遗症，对患者家属带来沉重的经济及精神上的负担，对患者的生活生存质量也影响甚深，而采用酶联免疫法检测较为经济实用。

CMV感染实验室诊断包括病毒分离、病毒抗原、DNA检测等[4]。虽然病毒培养阳性是诊断CMV感染“金指标”，但因其不能快速确诊，临床少用。CMV-IgM阳性为血清学检测，可提示潜伏病毒被激活或CMV近期活动性感染。IgM抗体产生虽有一定的滞后性，但检测费用低、方便、快速较为常用，且能反应病毒感染的状况以及通过检测，可以初步判断其治疗效果，故属于临床使用最广的实验室检测手段。但值得注意的是，IgM的检测结果还受机体免疫状态、时间窗等多种因素影响，可造成假阴性，故尚需综合考虑，结合患者临床症状体征及辅助检测，以尽早检测诊断患者的CMV病毒感染。虽然PCR检测CMV-DNA具有标本量小、敏感性高、快捷的特点，但PCR阳性并不一定存在有活动性的CMV感染，若作为CMV感染的诊断标准尚有欠妥当。

更昔洛韦对CMV抑制作用强，临床得到广泛肯定，采用酶联免疫法检测对比实验室的结果，与实际临床疗效相符合。

综上所述，检测CMVIgG能反应巨细胞病毒感染患者临床病情，可靠便捷，值得推广。

参考文献

[1]平鹦.新生儿巨细胞病毒感染的现状及治疗[J].上海医药，2007，28（5）：224

病毒实验室篇3

为进一步规范高致病性动物病原微生物实验活动审批行为，加强动物病原微生物实验室生物安全管理，现就有关事项通知如下。

一、严格掌握高致病动物病原微生物实验活动审批条件

高致病性动物病原微生物实验活动，事关重大动物疫病防控，事关实验室工作人员及广大人民群众身体健康和生命安全。省级以上兽医主管部门要高度重视高致病性动物病原微生物实验活动管理，认真贯彻实施《病原微生物实验室生物安全管理条例》，按照《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》规定的条件，严格高致病性动物病原微生物实验活动审批。

（一）高致病性动物病原微生物实验活动所需实验室生物安全级别。按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》规定，一级、二级实验室不得从事高致病性动物病原微生物实验活动；三级、四级实验室需要从事某种高致病性动物病原微生物或者疑似高致病性动物病原微生物实验活动的，应当经农业部或者省、自治区、直辖市人民政府兽医行政管理部门批准。经省级以上兽医主管部门批准的高致病性动物病原微生物实验活动，必须按照《动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》（附后）的要求，在相应生物安全级别的实验室内开展有关实验活动。

（二）高致病性动物病原微生物实验活动审批条件。三级、四级实验室从事高致病性动物病原微生物或者疑似高致病性动物病原微生物实验活动的，应当具备下列条件：一是必须取得农业部颁发的《高致病性动物病原微生物实验室资格证书》，并在有效期内；二是实验活动仅限于与动物病原微生物菌（毒）种或者样本有关的研究、检测、诊断和菌（毒）种保藏等；三是科研项目立项前必须经农业部批准。

二、严格规范高致病性动物病原微生物实验活动审批程序

省级以上兽医主管部门应当按照《高致病性动物病原微生物实验室生物安全管理审批办法》和农业部第898号公告规定的审批主体、审批程序，做好高致病性动物病原微生物实验活动审批工作。

（一）审批主体。从事下列高致病性动物病原微生物实验活动的，应当报农业部审批：一是猪水泡病病毒、非洲猪瘟病毒、非洲马瘟病毒、牛海绵状脑病病原和痒病病原等我国尚未发现的动物病原微生物；二是牛瘟病毒、牛传染性胸膜肺炎丝状支原体等我国已经宣布消灭的动物病原微生物；三是高致病性禽流感病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒等烈性动物传染病病毒。从事其他高致病性动物病原微生物实验活动的，由省、自治区、直辖市人民政府兽医主管部门审批。

（二）审批程序。实验室申请从事高致病性动物病原微生物实验活动的，应当向所在地省、自治区、直辖市人民政府兽医主管部门提出申请，并提交下列材料：一是高致病性动物病原微生物实验活动申请表一式两份；二是高致病性动物病原微生物实验室资格证书复印件；三是从事与高致病性动物病原微生物有关的科研项目，还应当提供科研项目立项证明材料。省级以上兽医主管部门按照职责分工，应当在收到申请材料之日起15日内做出是否审批的决定。

三、切实加强高致病性动物病原微生物实验活动监督管理

高致病性动物病原微生物实验活动管理是实验室生物安全监管的重点内容。各级兽医主管部门一定要认真贯彻实施《病原微生物实验室生物安全管理条例》的各项规定，采取切实有效措施，对高致病性动物病原微生物实验活动实行全程监管，确保实验室生物安全，确保实验室工作人员和广大人民群众身体健康。

（一）严肃查处违法从事实验活动的行为。各级兽医主管部门要严格执行高致病性动物病原微生物实验活动事前审批制度。对未经批准从事高致病性动物病原微生物实验活动的，要依法严肃查处，三年内不再批准该实验室从事任何高致病性动物病原微生物实验活动。

（二）加强实验活动监督检查。各级兽医主管部门要定期组织实验活动监督检查。重点检查实验室是否按照有关国家标准、技术规范和操作规程从事实验活动，及时纠正违规操作行为。要督促实验室加强内部管理，制定并落实安全管理、安全防护、感染控制和生物安全事故应急预案等规章制度。

病毒实验室篇4

空气质量的优劣直接影响到每个人的健康，空气消毒是净化室内空气，预防疾病，防止院内感染的重要措施。目前，医院内的空气消毒方法虽有多种，但均有不同程度的副作用，且使用欠方便。如何对医院室内空气进行清洁消毒，更是科学研究的重要内容和迫切需要解决的问题。为满足临床和社会的需要，我们采用三氧机与紫外线对室内空气进行消毒，经临床对照观察，三氧机效果优于紫外线，现报告如下：

1材料

肯格王牌三氧机、30W紫外线灯、普通琼脂培养机。

2方法

2.1空气采样和效果判断。空气消毒监测方法：按卫生部下发的《消毒技术规范》要求采用，根据消毒房间面积的大小，将直径9cm的普通琼脂培养基放在同一高度、同一位置，于消毒前后进行空气采样，培养基暴露5min，合闭后送检。

效果判断：按卫生部《消毒管理办法》中各类环境卫生标准。1类环境层流洁净手术室，层流洁净病房，空气细菌数≤10cfu/m3；2类环境：普通手术室、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌区、烧伤病房、重症监护病房，空气细菌数≤200cuf/m3；3类环境：儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、供应室清洁区、急诊室、化验室、各类普通病房和房间，细菌数≤500cfu/m3。

2.2临床对照观察。在我院选择手术室、供应室、治疗室、产房等作为消毒场所，按照研究要求，分实验组和对照组，2组均在彻底清洁室内卫生后进行消毒。实验组为三氧机，按每80m3的空间安装三氧机1部，消毒时关闭门窗，避免人员流动，消毒2小时。对照组为紫外线，室内每10m2面积安装30w紫外线灯管1支，距离地面2.5m灯亮5～7min计时，照射60min。2010年6月～2011年6月用上述方法进行抽样检查，每月1次，共采集样本12次。并于每次消毒前后进行空气采样细菌培养，记录细菌数。

3结果

临床对照结果如表1。从表1中可以看出，实验组和对照组均达到卫生部的消毒标准，但实验组效果明显优于对照组，经统计学处理，P

病毒实验室篇5

陈化兰是我国最早禽流感病毒（AIV）基因工程疫苗分子诊断及分子流行病学的研究者之一。她主持的农业部动物流感重点开放实验室是如今国内唯一有权对禽流感病毒进行最终病毒分离鉴定的研究机构，也是世界卫生组织全球动物流感监测网点实验室之一。该实验室分离鉴定了我国流行的禽流感病毒400多株，并建立了我国特有的禽流感病毒毒株信息资源库，所研制的禽流感诊断试剂和疫苗已在全国范围大面积推广、应用，创造了巨大的社会效益和经济效益。

责任驱使研究

“禽流感病毒能够造成巨大的灾难，它们可以害死数百万的鸟类；同时还能转到人类身上，带来疾病甚至死亡。我的实验室从事禽流感病毒的各方面研究，我们很想了解（病毒）在自然界中是怎样变化的，各种鸟类携带着哪些病毒。然后我们会在此基础上进行非常细致的生物学分析，以弄清这些病毒所带来的风险。最后我们会尝试研制疫苗。这就是我科研工作的过程。”陈化兰曾说。

与许多“”后有机会接受系统教育并开始职业生涯的科学家一样，陈化兰选择兽医学专业仅仅是出于偶然――她当年报考医学院的志愿被“微调”到兽医专业。这个从甘肃省白银县农村走出来的女娃，来到省城兰州读甘肃农业大学兽医系，先后获学士、硕士学位；1994年到哈尔滨攻读中国农业科学院研究生院传染病与预防兽医学专业，并在3年后获博士学位。

1999年，陈化兰前往美国疾病控制中心（CDC）进行博士后研究并显露出卓越才华，学习结束后，她回到了祖国。2002年底，陈化兰告别在美国做博士后的丈夫，带着两岁的儿子回到哈尔滨，把孩子托付给师妹提前代她雇好的保姆，便一头扎进了禽流感实验室。

在她的主持下，国家禽流感参考实验室加强了我国禽流感流行病学监测和研究的力度，建立了系统、完整的中国大陆禽流感病毒种毒株资源库及其流行病学信息数据库，阐明了我国禽流感病毒的分子遗传演化和抗原变异规律，为禽流感疫情的预警预报、诊断试剂及疫苗研制与使用等，提供了科学依据。

同时，针对我国禽流感疫情防控的需要，陈化兰开展了全方位的禽流感疫苗研究，获得多项重大突破。她主持研制的新型H5N1禽流感灭活疫苗是国际上首次研制成功并推向大规模应用的流感病毒反向基因操作疫苗，代表流感疫苗研制的国际先进水平和发展趋势，各项技术性能指标较H5N2灭活疫苗大幅提高，并在国内外首次证明可对水禽形成有效的免疫保护。

对抗质疑

首例H5N1人类感染出现在1997年的香港，而2003年的SARS疫情，更成为中国公共卫生及疾病控制工作的转折点。禽流感疾控乃是这一领域的重中之重，陈化兰一心希望找到治理这人间疾患的良药。

她的研究队伍通过混合H5N1和H1N1的基因片段，曾创造了127种杂交病毒样本。其中有5种杂交病毒显示出了空气传播性――相邻笼子中的豚鼠可以相互传染。这些研究结果，使得陈化兰的工作遭受到各种质疑，甚至有人称此项研究是“令人震惊地不负责任”，并说“这些研究人员是在没有任何常识的情况下受到了盲目野心的驱动”。

作为一名直率而坚定的科学家，陈化兰用自己的方式回应了各种质疑。在各种阻力之下，她所带领的国家禽流感参考实验室凭借其国际学术地位和近年来为全球禽流感防控作出的突出贡献，2008年被遴选为世界动物卫生组织（OIE）禽流感参考实验室，这也是我国第一个动物传染病OIE参考实验室。

2013年4月，陈化兰和她的科研团队发现，在我国导致人感染的新型H7N9流感病毒与同一时期存在于活禽市场上的H7N9禽流感病毒高度同源，这在国际上首次从病原学角度揭示了新型H7N9流感病毒来源，为科学防控H7N9禽流感提供了重要依据。

当年5月，他们又发现H5N1病毒确有可能通过与人流感病毒的基因重配，获得在哺乳动物之间高效空气传播的能力，从而具备引起人间大流行的潜力，从全新的角度揭示了H5N1病毒对全球公共卫生构成的现实威胁。两个月后，陈化兰和科研人员研究发现，H7N9病毒对禽类无致病力，但该病毒侵入人体发生突变后，对哺乳动物的致病力与水平传播能力得到明显增强，从而揭示了H7N9病毒存在较大人间大流行的风险。2013年年底，陈化兰入选英国《自然》杂志评选出的2013年年度十大科学人物，获选理由为帮助中国平息H7N9禽流感疫情。

平淡是真

陈化兰的办公室位于哈尔滨市南岗区一座僻静的旧楼里，墙外就是繁华的马路。在这里，除了大门紧闭的P3实验室外，你并不能感受到与紧张的疫情有关的气氛，也看不到太多冰冷的生物实验设备。

病毒实验室篇6

摘要：

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒（MERS－CoV）感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS－CoV三个分子靶标（upE，ORF1b，N2）的双重以及三重的三种荧光定量RT－PCR检测技术方法，分别与前期建立的单重荧光定量RT－PCR（upE或N2）检测方法做了比较，并且采用MERS－CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS－CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示：采用MERS－CoV病毒毒株作为模板，三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT－PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU／mL，且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应，特异性良好。对临床样品的验证中，上海病人咽拭子样本均为阴性，而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性，而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率，明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS－CoV三个分子靶标的双重以及三重荧光定量RT－PCR检测技术方法用于MERS－CoV感染的实验室诊断，具有较高灵敏度与特异性及适用性。

关键词：

中东呼吸系统综合征；冠状病毒；荧光定量RT－PCR；多重；检测

中东呼吸综合征是由中东呼吸综合征冠状病毒感染所致的急性呼吸道传染病，是继严重急性呼吸综合征冠状病毒后的一种新发现的感染力强、病死率高、可在人群当中传播的冠状病毒，病毒溯源分析提示其可能来源于蝙蝠或中东沙漠地区的单峰骆驼［1，2］。MERS－CoV为有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约30kb，该病毒基因组结构与其他已知的人类冠状病毒相似，至少含有10个开放读码框架（openreadingframe，ORF），编码病毒的多种结构蛋白和非结构蛋白［3］。与其他冠状病毒所致的肺部感染相比，MERS－CoV感染的临床表现没有特征性差异，因此MERS－CoV确诊病例的诊断需依据实验室病原学检测结果。MERS－CoV的实验室检测包括病毒核酸检测、抗原抗体检测及病毒分离鉴定［4－6］。其中，核酸检测方法中的荧光定量RT－PCR方法具有时间短、灵敏度高、特异性好等优势，是目前广泛应用于MERS－CoV感染筛查与实验室确诊的工具［7］。各国科学家相继建立了针对MERS－CoV多个靶标的单重荧光定量RT－PCR方法［8］，主要包括N基因，E蛋白上游、ORF1b及ORF1a。世界卫生组织于2014年9月颁布MERS－CoV实验室诊断标准流程，认为ORF1b具有较好检测特异性，但推荐以病毒E蛋白上游一段基因作为临床样品的初筛检测靶标，两个靶标同时阳性可确认MERS－CoV阳性。我们实验室前期也已建立多种针对不同靶标的单重荧光定量RT－PCR方法［7］，通过对中国首例MERS－CoV输入病例的检测发现：N2的检测灵敏度优于upE．为改进目前MERS－CoV核酸检测方法，本研究基于upE，ORF1b，N2三个靶标，建立了三种双重或三重MERS－CoV的荧光定量RT－PCR核酸检测技术，采用从荷兰伊拉莫斯医学中心引进的MERS－CoV病毒毒株［9］、上海市出入境检验检疫局提供的发热病人样品以及中国MERS输入病例的咽拭子和全血样品［7］做了临床验证。

一、材料与方法

1临床样品从荷兰伊拉莫斯医学中心引进MERS－CoV病毒毒株（hCoV－EMC）［3，9］，进行病毒培养并将病毒培养物梯度稀释于适当缓冲基质（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所以统一使用的VTM病毒转运培养基）中，得到不同浓度的MERS－CoV病毒培养物稀释液，用于实验方案的检测下限的确定及灵敏度验证。上海市出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品，以及广东省中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的1份全血样品和3份咽拭子样品，均用于实验室实验方法的临床验证。病毒培养与送检样本经中国疾病预防控制中心BSL－3实验室分装灭活。感染其他常见呼吸道病毒并经实验确定的发热人员咽拭子样品［10］（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所保存）用于检测方法特异性的验证。

2样品核酸提取所有MERS－CoV病毒或临床样品首先经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所BSL－3实验室病毒灭活，其他样品在BSL－2实验室灭活病毒。每个样品均采用140μl进行病毒核酸提取，溶于60μl纯水，得到核酸样品提取液。

3方法设计

3．1引物及方案设计查阅文献与基因序列比对，选择基于upE，ORF1b，N2三个靶标建立双重以及三重MERS－CoV的核酸检测方案，引物设计及实验方案见表1。

3．2荧光定量PCR检测选取TaKaRa一步法荧光定量PCR试剂盒（OneStepPrimeScriptRT－PCRKit，宝生物），反应体系：2×RT－PCRbuffer12．5μl，TaKaRaExTagHS，引物（20μM）、探针（20μM）（参见表1），加水至20μl体系。分别加入样品核酸提取液、阴性对照各5μl。于BioRedCFX96实时荧光定量PCR系统设置反应程序：42℃5min，95℃10s，95℃10s，60℃45s，共40个循环，在60℃检测荧光。

3．3检出下限及灵敏度验证MERS－CoV病毒培养物进行滴度定量，然后灭活病毒培养物并进行倍比稀释，提取倍比稀释的病毒核酸稀释液样品，用于对各实验方案的检测下限和灵敏度的确认。

3．4特异性验证选取实验室保存的常见呼吸道病毒核酸阳性的临床咽拭子样品［10］，对各实验方案的特异性进行验证，阳性样品包括有：HCoV－NL63，HCoV－229E，HCoV－OC43，HCoV－HKU1，流感病毒A／B型，人鼻病毒，呼吸道合胞病毒，副流感1、2、3、4型，腺病毒，人偏肺病毒，人博卡病毒。

3．5多重检测体系比较依据方案设计（表1），进行双重和三重荧光定量RT－PCR实验方法的确立，并分别与相对应的单重荧光定量RT－PCR方法进行比较验证。3．6临床样品验证采用上海市出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品，以及广东省疾病预防控制中心送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的1份全血样品和3份咽拭子样品进行实验室实验方案的临床验证。

二、结果

1检出下限确定以6个倍比稀释的核酸稀释液样品为模板，每个梯度重复3次实验，优化多重体系后，方案一、方案二、方案三均能达到最低检测限为10PFU／ml，且不同检测批次具有较好的重复性，见表2。

2特异性分析针对upE／ORF1b／N2三个靶标的扩增曲线见图1。以其他常见呼吸道病毒阳性的临床样品核酸为模板，分别进行双重和三重荧光定量RT－PCR反应，结果分析后均无MERS－CoV核酸扩增信号，无交叉反应，特异性良好。3临床样品检测验证采用上海出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品，以及广东省疾控中心送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的3份咽拭子样品进行MERS冠状病毒检测方案进行验证，结果表明针对upE／ORF1b和upE／N2双靶标双色检测方法及upE／ORF1b／N2三靶标检测方法结果与前期建立的单重荧光定量RT－PCR（N2／ORF1b／upE）检测结果一致，显示检测结果见表3，三种实验方案均有良好的特异性扩增动力学特点，见图1。Ct值N2靶标＜upE靶标＜ORF1b靶标（表3）。1份输入性MERS冠状病毒病人的全血样品的检测结果表明：只有含N2靶标的单重或多重荧光定量RT－PCR才能检出阳性。故三种MERS冠状病毒检测方案均可应用于MERS冠状病毒核酸检测，且含N2靶标的检测方案具有最好检测灵敏度，适合于初筛。

三、讨论