分子生物学技术篇1

摘要本文根据近期的文献资料，分析研究了目前国际海洋生物技术研究发展特点。重点领域及最新研究进展，展望对世纪海洋生物技术研究的发展趋势，并就我国海洋生物技术发展提出相应的建说。关键词海洋生物技术发展展望近10年来，由于海洋在沿海国家可持续发展中的战略地位日益突出，以及人类对海洋环境特殊性和海洋生物多样性特征的认识不断深入，海洋生物资源多层面的开发利用极大地促进了海洋生物技术研究与应用的迅速发展。1989年首届国际海洋生物技术大会（以下简称MPS大会）在日本召开时仅有几十人参加，而1997年第四届IMBC大会在意大利召开时参加入数达1000多人。现在IMBC会议已成为全球海洋生物技术发展的重要标志，出现了火红的局面。《IMBC2000》在澳大利亚刚刚开过，《IMBC2003》的筹备工作在日本已经开始，以色列为了举办们《IMBC2006》早早作了宣传，并争到了举办权。每3年一届的IMBC不仅吸引了众多高水平的专家学者前往展示与交流研究成果，探讨新的研究发展方向，同时也极大地推动了区域海洋生物技术研究的发展进程。在各大洲，先后成立了区域性学术交流组织，如亚太海洋生物技术学会、欧洲海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会等。各国还组建了一批研究中心，其中比较著名的为美国马里兰大学海洋生物技术中心、加州大学圣地亚哥分校海洋生物技术和环境中心，康州大学海洋生物技术中心，挪威贝尔根大学海洋分子生物学国际研究中心和日本海洋生物技术研究所等。这些学术组织或研究中心不断举办各种专题研讨会或工作组会议研究讨论富有区域特色的海洋生物技术问题。1998年在欧洲海洋生物技术学会、日本海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会的支持下，原《海洋生物技术杂志》与《分子海洋生物学和生物技术》合刊为《海洋生物技术》学报（以下简称MBT），现在它已成为一份具有权威性的国际刊物。海洋生物技术作为一个新的学科领域已明确被定义为“海洋生命的分子生物学如细胞生物学及其它的技术应用”。为了适应这种快速发展的形势，美国、日本、澳大利亚等发达国家先后制定了国家发展计划，把海洋生物技术研究确定为21世纪优先发展领域。1996年，中国也不失时机地将海洋生物技术纳入国家高技术研究发展计划（863计划），为今后的发展打下了基础。不言而喻，迄今海洋生物技术不仅成为海洋科学与生物技术交叉发展起来的全新研究领域，同时，也是21世纪世界各国科学技术发展的重要内容并将显示出强劲的发展势头和巨大应用潜力。1．发展特点表1和表2列出的资料大体反映了当前海洋生物技术研究发展的主要特点。1.1加强基础生物学研究是促进海洋生物技术研究发展的重要基石海洋生物技术涉及到海洋生物的分子生物学、细胞生物学、发育生物学、生殖生物学、遗传学、生物化学、微生物学，乃至生物多样性和海洋生态学等广泛内容，为了使其发展有一个坚实的基础，研究者非常重视相关的基础研究。在《IMBC2000》会议期间，当本文作者询问一位资深的与会者：本次会议的主要进步是什么？他毫不犹豫的回答：分子生物学水平的研究成果增多了。事实确实如此。近期的研究成果统计表明，海洋生物技术的基础研究更侧重于分子水平的研究，如基因表达、分子克隆、基因组学、分子标记、海洋生物分子、物质活性及其化合物等。这些具有导向性的基础研究，对今后的发展将有重要影。1.2推动传统产业是海洋生物技术应用的主要方面目前，应用海洋生物技术推动海洋产业发展主要聚焦在水产养殖和海洋天然产物开发两个方面，这也是海洋生物技术研究发展势头强劲。充满活力的原因所在。在水产养殖方面，提高重要养殖种类的繁殖、发育、生长和健康状况，特别是在培育品种的优良性状、提高抗病能力方面已取得令人鼓舞的进步，如转生长激素基因鱼的培育、贝类多倍体育苗、鱼类和甲壳类性别控制、疾病检测与防治、DNA疫苗和营养增强等；在海洋天然产物开发方面，利用生物技术的最新原理和方法开发分离海洋生物的活性物质、测定分子组成和结构及生物合成方式、检验生物活性等，已明显地促进了海洋新药、酶、高分子材料、诊断试剂等新一代生物制品和化学品的产业化开发。MBC大会研讨的主要内容表2近期IMBC大会和《MarineBiotechnology》学报论文统计表1.3保证海洋环境可持续利用是海洋生物技术研究应用的另一个重要方面利用生物技术保护海洋环境、治理污染，使海洋生态系统生物生产过程更加有效是一个相对比较新的应用发展领域，因此，无论是从技术开发，还是产业发展的角度看，它都有巨大的潜力有待挖掘出来。目前已涉及到的研究主要包括生物修复（如生物降解和富集、固定有毒物质技术等）、防生物附着、生态毒理、环境适应和共生等。有关国家把“生物修复”作为海洋生态环境保护及其产业可持续发展的重要生物工程手段，美国和加拿大联合制定了海洋环境生物修复计划，推动该技术的应用与发展。1.4与海洋生物技术发展有关的海洋政策始终是公众关注的问题其中海洋生物技术的发展策略、海洋生物技术的专利保护、海洋生物技术对水产养殖发展的重要性、转基因种类的安全性及控制问题、海洋生物技术与生物多样性关系以及海洋环境保护等方面的政策、法规的制定与实施倍受关注。2.重点发展领域当前，国际海洋生物技术的重点研究发展领域主要包括如下几个方面：2.1发育与生殖生物学基础弄清海洋生物胚胎发育、变态、成熟及繁殖各个环节的生理过程及其分子调控机理，不仅对于阐明海洋生物生长、发育与生殖的分子调控规律具有重要科学意义，而且对于应用生物技术手段，促进某种生物的生长发育及调控其生殖活动，提高水产养殖的质量和产量具有重要应用价值。因此，这方面的研究是近年来海洋生物技术领域的研究重点之一。主要包括：生长激素、生长因子、甲状腺激素受体、促性腺激素、促性腺激素释放激素、生长一催乳激素、渗透压调节激素、生殖抑制因子、卵母细胞最后成熟诱导因子、性别决定因子和性别特异基因等激素和调节因子的基因鉴定、克隆及表达分析，以及鱼类胚胎于细胞培养及定向分化等。2.2基因组学与基因转移随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划的实施，各种生物的结构基因组和功能基因组研究成为生命科学的重点研究内容，海洋生物的基因组研究，特别是功能基因组学研究自然成为海洋生物学工作者研究的新热点。目前的研究重点是对有代表性的海洋生物（包括鱼、虾、贝及病原微生物和病毒）基因组进行全序列测定，同时进行特定功能基因，如药物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐盐基因等的克隆和功能分析。在此基础上，基因转移作为海洋生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段，已成为该领域应用技术研究发展的重点。近几年研究重点集中在目标基因筛选，如抗病基因、胰岛素样生长因子基因及绿色荧光蛋白基因等作为目标基因；大批量、高效转基因方法也是基因转移研究的重点方面，除传统的显微注射法、基因枪法和携带法外，目前已发展了逆转录病毒介导法，电穿孔法，转座子介导法及胚胎细胞介导法等。2.3病原生物学与免疫随着海洋环境逐渐恶化和海水养殖的规模化发展，病害问题已成为制约世界海水养殖业发展的瓶颈因子之一。开展病原生物（如细菌、病毒等）致病机理、传播途径及其与宿主之间相互作用的研究，是研制有效防治技术的基础；同时，开展海水养殖生物分子免疫学和免疫遗传学的研究，弄清海水鱼、虾、贝类的免疫机制对于培育抗病养殖品种、有效防治养殖病害的发生具有重要意义。因此，病原生物学与免疫已成为当前海洋生物技术的重点研究领域之一，重点是病原微生物致病相关基因、海洋生物抗病相关基因的筛选、克隆，海洋无脊椎动物细胞系的建立、海洋生物免疫机制的探讨、DNA疫苗研制等。2.4生物活性及其产物海洋生物活性物质的分离与利用是当今海洋生物技术的又一研究热点。现人研究表明，各种海洋生物中都广泛存在独特的化合物，用来保护自己生存于海洋中。来自不同海洋生物的活性物质在生物医学及疾病防治上显示出巨大的应用潜力，如海绵是分离天然药物的重要资源。另外，有一些海洋微生物具有耐高温或低温、耐高压、耐高盐和财低营养的功能，研究开发利用这些具特殊功能的海洋极端生物可能获得陆地上无法得到的新的天然产物，因而，对极端生物研究也成为近年来海洋生物技术研究的重点方面。这一领域的研究重点包括抗肿瘤药物、工业酶及其它特殊用途酶类、极端微生物定功能基因的筛选、抗微生物活性物质、抗生殖药物、免疫增强物质、抗氧化剂及产业化生产等。2.5海洋环境生物技术该领域的研究重点是海洋生物修复技术的开发与应用。生物修复技术是比生物降解含义更为广泛，又以生物降解为重点的海洋环境生物技术。其方法包括利用活有机体、或其制作产品降解污染物，减少毒性或转化为无毒产品，富集和固定有毒物质（包括重金属等），大尺度的生物修复还包括生态系统中的生态调控等。应用领域包括水产规模化养殖和工厂化养殖、石油污染、重金属污染、城市排污以及海洋其他废物（水）处理等。目前，微生物对环境反应的动力学机制、降解过程的生化机理、生物传感器、海洋微生物之间以及与其它生物之间的共生关系和互利机制，抗附着物质的分离纯化等是该领域的重要研究内容。3.前沿领域的最新研究进展3.1发育与生殖调控应用GIH（性腺抑制激素）和GSH（性腺刺激激素）等激素调控甲壳类动物成熟和繁殖的技术「1，研究了甲状腺激素在金绍生长和发育中的调控作用，发现甲状腺激素受体mRNA水平在大脑中最高，在肌肉中最低，而在肝、肾和鳃中表达水平中等，表明甲状腺素受体在成体金银脑中起着重要作用「1，对海鞘的同源框（Homeobox）基因进行了鉴定，分离到30个同源框基因「1，建立了青鳉的同源框（Homeobox）基因「1，建立了青鳉胚胎干细胞系并通过细胞移植获得了嵌合体青鳉「1，建立了虹鳟原始生殖细胞培养物并分离出Vasa基因「2，进行斑节对虾生殖抑制激素的分离与鉴定「2，应用受体介导法筛选GnRH类似物，用于鱼类繁殖「2，建立了海绵细胞培养技术，用于进行药物筛选「2，建立了将海胆胚胎作为研究基因表达的模式系统「2，通过基因转移开展了海胆胚胎工程的研究「2，研究了人葡糖转移酶和大鼠已糖激酶cDNA在虹鳟胚胎中的表达［3］，建立了通过细胞周期蛋白依赖的激酶活性测定海水鱼苗细胞增殖速率的方法「3，研究了几丁质酶基因在斑节对虾蜕皮过程中的表达［4］，从海参分离出同源框基因，并进行了序列的测定「4。3.2功能基因克隆建立了牙鲆肝脏和脾脏mRNA的表达序列标志，从深海一种耐压细菌中分离到压力调节的操纵子，从大西洋鲑分离到雌激素受体和甲状腺素受体基因，从挪威对虾中分离到性腺抑制激素基因「1；将DNA微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了班节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻EST，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类IGF－I原E一肽具有抗肿瘤作用「2；构建了海洋酵母De—baryomyceshansenii的质粒载体，从鲤鱼血清中分离纯化出蛋白酶抑制剂，从兰蟹血细胞中分离到一种抗菌肽样物质，从红鲍分离到一种肌动蛋白启动子，发现依赖于细胞周期的激酶活性可用作海洋鱼类苗种细胞增殖的标记，克隆和定序了鳗鱼细胞色素P4501AcD－NA，通过基因转移方法分析了鳗细胞色素P450IAI基因的启动子区域，分离和克隆了鳗细胞色素P450IAI基因，建立了适宜于沟绍遗传作图的多态性EST标记，构建了黄盖鲽EST数据库并鉴定出了一些新基因，建立了班节对虾一些组织特异的EST标志，从经HirameRhabdovirus病毒感染的牙鲆淋巴细胞EST中分离出596个cDNA克隆「3；用PCR方法克隆出一种自体受精雌雄同体鱼类的ß一肌动蛋白基因，从金鲷cDNA文库中分离出多肽延伸因子EF－2CDNA克隆，在湖鳟基因组中发现了TC1样转座子元件「4；鉴定和克隆出的基因包括：南美白对虾抗菌肽基因、牡蛎变应原（allergen）基因、大西洋鳗和大西洋鲑抗体基因、虹鳟Vasa基因、青鳉P53基因组基因、双鞭毛藻类真核启始因子5A基因、条纹鲈GtH（促性腺激素）受体cDNA、鲍肌动蛋白基因、蓝细菌丙酮酸激酶基因、鲤鱼视紫红质基因调节系列以及牙鲆溶菌酶基因等［1—4］。3.3基因转移分离克隆了大马哈鱼IGF基因及其启动子，并构建了大马哈鱼IGF（胰岛素样生长因子）基因表达载体「1。通过核定位信号因子提高了外源基因转移到斑马鱼卵的整合率「1，建立了快速生长的转基因罗非鱼品系并进行了安全性评价；对转基因罗非鱼进行了三倍体诱导，发现三倍体转基因罗非鱼尽管生长不如转基因二倍体快，但优于未转基因的二倍体鱼，同时，转基因三倍体雌鱼是完全不育的，因而具有推广价值「2；研究了超声处理促进外源DNA与金鲷结合的技术方法，将GFP作为细胞和生物中转基因表达的指示剂；表明转基因沟鲶比对照组生长快33％，且转基因鱼逃避敌害的能力较差，因而可以释放到自然界中，而不会对生态环境造成大的危害「3；应用GFP作为遗传标记研究了斑马鱼转基因的条件优化和表达效率「3；在抗病基因工程育种方面，构建了海洋生物抗菌肽及溶菌酶基因表达载体并进行了基因转移实验「2；在转基因研究的种类上，目前已从经济养殖鱼类逐步扩展到养殖虾、贝类及某些观赏鱼类「2.3。通过基因枪法将外源基因转到虹鳟肌肉中获得了稳定表达「4。3.4分子标记技术与遗传多样性研究了将鱼类基因内含子作为遗传多样性评价指标的可行性，应用SSCP和定序的方法研究了大西洋和地中海几种海洋生物的遗传多样性「1。研究了南美白对虾消化酶基因的多态性「1；利用寄生性原生动物和有毒甲藻基因组DNA的间隔区序列作标记检测环境水体中这些病原生物的污染程度，应用18S和5.8S核糖体RNA基因之间的第一个内部间隔区(ITC—1)序列作标记进行甲壳类生物种间和种内遗传多样性研究「2；研究了斑节对虾三个种群的线粒体DNA多态性，用PCR技术鉴定了夏威夷Gobioid苗的种类特异性。通过测定内含子序列揭示了南美白对虾的种内遗传多样性，采用同功酶、微卫星DNA及RAPD标记对褐鳟不同种群的遗传变异进行了评价，在平鱼鉴定并分离出12种微卫星DNA，在美国加州鱿鱼上发现了高度可变的微卫星DNA「3；弄清了一种深水鱼类（Gonostomagracile）线粒体基因组的结构，并发现了硬骨鱼类tRNA基因重组的首个实例，测定了具有重要商业价值的海水轮虫的卫星DNA序列，用RAPD技术在大鲮鲆和鳎鱼筛选到微卫星重复片段，从多毛环节动物上分离出高度多态性的微卫星DNA，用RAPD技术研究了泰国东部泥蟹的遗传多样性「3；用AFLP方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献「4。3.5DNA疫苗及疾病防治构建了抗鱼类坏死病毒的DNA疫苗「1；开展了虹鳟IHNVDNA疫苗构建及防病的研究，表明用编码IHNV糖蛋白基因的DNA疫苗免疫虹鳟，诱导了非特异性免疫保护反应，证明DNA免疫途径在鱼类上的可行性，从虹鳟细胞系中鉴定出经干扰素可诱导的蛋白激酶「2；建立了养殖对虾病毒病原检测的ELISA试剂盒，用PCR等分子生物学技术鉴定了虾类的病毒性病原，将鱼类的非特异性免疫指标用于海洋环境监控，研究了抗病基因转移提高鲷科鱼类抗病力的可行性，研究了蛤类唾液酸凝集素的抗菌防御反映「2；研究了一种海洋生物多糖及其衍生物的抗病毒活性「3；建立了测定牡蛎病原的PCR—ELISA方法「3；研究了LatrunculinB毒素在红海绵体内的免疫定位「4。3.6生物活性物质从海藻中分离出新的抗氧化剂「1，建立了大量生产生物活性化合物的海藻细胞和组织培养技术，建立了通过海绵细胞体外培养制备抗肿瘤化合物的方法「1；从不同生物（如对虾和细菌）中鉴定分离出抗微生物肽及其基因，从鱼类水解产物中分离出可用作微生物生长底物的活性物质，海洋生物中存在的抗附着活性物质，用血管生成抑制剂作为抗受孕剂，从蟹和虾体内提取免疫激活剂，从海洋藻类和蓝细菌中纯化光细菌致死化合物，海星抽提物在小鼠上表现出批精细胞形成的作用，从海洋植物Zosteramarina分离出一种无毒的抗附着活性化合物，从海绵和海鞘抽提物分离出抗肿瘤化合物，开发了珊瑚变态天然诱导剂，从海胆中分离出一种抗氧化的新药，在海洋双鞭毛藻类植物中鉴定出长碳链高度不饱和脂肪酸（C28），表明海洋真菌是分离抗微生物肽等生物活性化合物的理想来源「2；发现海洋假单胞杆菌的硫酸多糖及其衍生物具有抗病毒活性，从硬壳蛤分离出谷光甘肽一S一转移酶，从鲤血清中分离出丝氨酸蛋白酶抑制剂，从海绵中分离出氨激脯氨酸二肽酶，从一种珊瑚分离出具DNA酶样活性的物质，建立了开放式海绵养殖系统，为生物活性物质的大量制备提供了充足的海绵原料「3；从虾肌水解产物中分离到抗氧化肽物质「4；从一种海洋细菌中分离纯化出N一乙酸葡糖胺一6一磷酸脱乙酸酶「4。3.7生物修复、极端微生物及防附着研究了转重金属硫蛋白基因藻类对海水环境中重金属的吸附能力，表明明显大于野生藻类「1，研究了石油降解微生物在修复被石油污染的海水环境上的可疗性及应用潜力「1；研究了海洋磁细菌在去除和回收海水环境中重金属上的应用潜力「1；用Bacillus清除养鱼场污水中的氮，用分子技术筛选作为海水养殖饵料的微藻，开发了六价铬在生物修复上的应用潜力，分离出耐冷的癸烷降解细菌，研究了海洋环境中多芳香化烃的微生物降解技术「2；从噬盐细菌分离出渗透压调节基因，并生产了重组Ectoine（渗透压调节因子），从2650米的深海分离到一种耐高温的细菌，这种细菌可用来分离耐高温和热稳定的酶，在耐高温的archaea发现了D型氨基酸和无氧氨酸消旋酶，测定了3种海洋火球菌的基因组DNA序列，借助于CROSS／BLAST分析进行了特定功能基因的筛选，从海底沉积物、海水和北冰洋收集了1000多种噬冷细菌，并从这些细菌中分离到多种冷适应的酶「2；建立了一种测定藤壶附着诱导物质的简单方法，研究了Chlorophyta和共生细菌之间附着所必需的形态上相互作用，研究了珊瑚抗附着物质（dterpene）类似物的抗附着和麻醉作用「3；分析了海岸环境中污着的起始过程，并对沉积物和附着物的影响进行了检测「4。4．展望与建议上述研究分析表明，海洋生物技术作为一个全新的学科，已成为21世纪海洋研究开发的重要领域，并沿着三个应用方向迅速发展。一是水产养殖，其目标十分清楚就是要提升传统产业，促使水产养殖业在优良品种培育、病害防治、规模化生产等诸多方面出现跨越式的发展；二是海洋天然产物开发，其目标是探索开发高附加值的海洋新资源，促进海洋新药、高分子材料和功能特殊的海洋生物活性物质产业化开发；三是海洋环境保护，其目标是保证海洋环境的可持续利用和产业的可持续发展。令人可喜的是这个应用发展趋势与我国海洋产业的发展需求，特别是与我国海洋生物资源可持续开发利用的高技术需求相一致「5。事实上，在过去5年中我国海洋生物技术的研究应用已经取得了长足的进步，取得了一批具世界先进水平的研究成果，在推动海洋产业发展中发挥了重要作用。进入21世纪，加大海洋863的支持力度，进一步促进我国海洋生物技术快速发展的势头，不仅有现实的意义，也是具有战略价值的举措。另外，面对科技全球化的挑战，多渠道地加强国际合作与交流，促进我国海洋生物技术创新和产业化向更高层面上发展也是十分重要的。从技术应用的角度看，海洋生物技术主要是利用海洋环境特殊性和生物多样性特征，从分子和细胞水平上，即从高技术水平上多层面地开发利用海洋生物群体资源。遗传资源和天然产物资源，那么与此相关的基础研究就显得十分重要了。事实上，这也是一种国际研究发展趋势。为了弥补这方面的不足，在我国海洋生物技术发展过程中需要有多方面支持和配合，不仅要与《国家重点基础研究发展规划》、《国家自然科学基金》等相关计划沟通、衔接，还需要加强基础性建设。既需要加强中试基地和产业化基地建设，也需要加强基础设施建设，如加强开放实验室、研究基地、生物多样性资源库、种子库、信息数据库的建设。这些措施对我国海洋生物技术向更高水平发展具有深远意义.

分子生物学技术篇2

纳米技术分为三种概念：

1、是1986年美国科学家德雷克斯勒博士在《创造的机器》一书中提出的分子纳米技术。根据这一概念，可以使组合分子的机器实用化，从而可以任意组合所有种类的分子，可以制造出任何种类的分子结构。这种概念的纳米技术还未取得重大进展。

2、把纳米技术定位为微加工技术的极限。也就是通过纳米精度的“加工”来人工形成纳米大小的结构的技术。这种纳米级的加工技术，也使半导体微型化即将达到极限。

分子生物学技术篇3

关键词：分子生物学；技术；昆虫生态学

分子生态学是应用分子进化和群体遗传学的理论、分子生物学的技术手段、系统发生学和数学的分析方法及其他学科的知识（如地理学、古气候学等）去研究种群、进化、生态、行为、分类、生物地理演化、生物保护等学科领域的各种问题。它主要通过大量使用分子生物学先进的技术和方法，在分子水平上研究生态现象，阐明生态现象的分子机制。昆虫分子生态学就是以昆虫作为研究对象，应用分子生态学的原理与方法研究昆虫进化和适应机制的一门科学。它主要通过分子生物学的方法检查昆虫种群或个体的遗传变异，分析和解释遗传变异的特点与规律，揭示遗传变异所反应的规律性的东西，从而进一步阐明昆虫之间一级昆虫与环境之间的相互作用关系。其研究的最典型特色是运用分子遗传标记来检测研究对象的遗传变异特征，揭示昆虫的演化规律。在昆虫分子生态学研究中应用较多的分子生物学标记技术有：同工酶（蛋白质电泳）方法、限制性片段长度多态性（RFLP）方法、随机扩增DNA多态性（RAPD）方法、扩增片段长度多态性（AFLP）及微卫星标记方法（SSR）及单核苷酸多态性(SNP)。其中，目前应用最多，最简便的是SSR和SNP技术。下面我们主要介绍在昆虫生态学研究中几种常用分子标记方法。

1.同工酶方法的应用

同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子结构不同的一类酶。自从Hunter和Markert创立同工酶酶谱技术后，同工酶谱的变化即可作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标。在昆虫分子生态学发展之初，同工酶被广泛应用与昆虫的分类、种群间抗性的遗传变异等方面，随着分子生物学技术的广泛应用，同工酶技术已慢慢被淘汰。

2.RFLP技术的应用

RFLP又叫作RestrictionFragmentLengthPolymorphism.即我们所说的限制性内切酶片段长度多态性，而且他作为第一代的生物分子类标记技术，这种技术是指通过已经发现的限制性内切酶来处理不同生物个体的DNA，通过利用限制性内切酶的多种特异性来达到获得不同的DN段的目的，这种技术一般是被应用于分子杂交，放射性同位素的显微技术中，而且也只是主要用于研究生物遗传的研究中，自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中。在昆虫生态学研究中可以用于昆虫遗传谱图的分析、遗传连锁图的构建及数量遗传性状等方面的研究。

3.RAPD技术的应用

RAPD，俗名是随机扩增多态性DNA技术，它是由两位美国科学家Wiliams和Welsh在1990年提出的，而且他们并不是研究的合作者，而是分开研究的，这种技术又被称作任意引物PCR。对于RAPD来说，它所使用的物质是十分不相同的，但是对于现存的所有引发物来说，他对于在DNA序列碱基序列上的特定结合位点来说，一旦这些特异性DNA位点达到了基因组分布的扩增条件，他就会根据DNA碱基对的配位原则，完成DNA另一条链的合成。

4.AFLP技术的应用

植物基因组的AFLP中的酶切，连接和pcr问题，只要酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果才对，AFLP技术的关键就是把握体系的问题，每一个实验室应该有自己的一套体系，照着做一般没有问题，分子标记，就是纯体力劳动，做得很多一般就会有结果的，这是量变到质变的过程。做AFLP需要用到试剂盒，但试剂盒不如自己做省事，也没必要。除非你做的量少。但是分子标记要的就是大量重复性的劳动。因此，试剂盒不如自己做省事，也没必要，并且试剂盒中很重要的酶往往量不够用，比如T4连接酶和内切酶EcoRI，除非你做的量很少，且不需要摸索体系。酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果，也不一定。接头制作和连接体系也很重要，连接时间一般影响不是很大。

5.微卫星标记技术在昆虫生态学研究中的应用

微卫星标记ms是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。自1981年Spritz首先在珠蛋白中发现微卫星序列到今天微卫星序列在生物学中的广泛应用,微卫星标记技术走过了近30多年的发展变化。其中，20世纪80、90年代是微卫星技术从开始到逐渐成熟的关键阶段。1982年Hamada等在研究真核生物基因组中Z-DNA形成时发现了一种新的重复因素——选择性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys等通过对小卫星(minisatellite)的DNA指纹图谱鉴定证明了串联重复的DNA具有很高的长度差异性。与此同时，Tautz等的研究表明，这种“神秘而简单冶的DNA序列是遗传变异的重要来源。1989年Tautz首次应用了基于PCR的微卫星分型技术。随着微卫星分子标记的广泛使用，科研工作者对其进化、功能及在基因组中的分布等研究的了解迅速增加。近年来，微卫星分子标记也被广泛应用于昆虫学研究的各个领域。截至2012年6月，共有16396个昆虫上微卫星位点在NCBI中记录，其中双翅目、鳞翅目和膜翅目昆虫的微卫星登录数量最多，占75%。这些微卫星被广泛应用于昆虫遗传作图、种群遗传学研究、个体亲缘关系鉴定等方面。

6.SNP在昆虫分子生态学中的应用

SNP(SingleNucleotidePolymorphism)即单核苷酸多态性标记，又称单核苷酸多态性，指DNA序列中单个碱基的差别，碱基对由于排列方式不同，结合不同脱氧核苷酸对，这些核苷酸对构成密码子，密码子则以不同的排列顺序编码蛋白质，从而形成自然界多种多样的生命。SNP在基因组可以划分为两种形式：一是基因编码区的功能性突变，主要分布在基因编码区，故又称为cSNP，这类SNP较少，其变异率仅占周围序列的1/5，但因其在遗传疾病研究中具有重要意义而备受关注；二是遍布于基因组的大量碱基变异。就现在来说，SNP技术已经开始广泛用于昆虫分子生态学，包括昆虫种间鉴定，遗传图谱的分析、入侵害虫种群间亲缘关系的区分等研究。生态学的发展，SNP技术的萌芽是古人生态意识的总和，在古时，古人并不了解整个自然界，但是他们通过长期的打鱼，农牧以及狩猎积累了大量的朴素的生态学知识，比如说农作物的生长与季候的关系、常见的动物有哪些习性等等，在公园前四世纪时，希腊学者亚里士多德就曾经粗略的描述了动物有种不同的栖息地，还根据动物生活栖息地的特点将其分为了水栖和路栖，根据它的食性分成肉食和草食，还有杂食动物等等。随着人类社会的发展，人们对于生态的认识不再仅仅局限于以往的知识积累，人们通过自己的主动探究从而能够获得有关于自然界的种种知识，最后能够形成一个全面的生态学理念极其生态学系统的认知应用。本文通过描述几种技术在昆虫生态系统的运用从而得到现在科技在生态系统中的应用等等相关关系，这种应用不仅使各种技术得到提高，还对我们生态系统的探索起着极大的作用。

参考文献

[1]郭晓霞，郑哲民，于广志.同工酶在昆虫分类和进化研究中的意义[J].昆虫知识，2000，37（6）：371-374.

分子生物学技术篇4

关键词：田径；推铅球；生物力学

中图分类号：G824.1文献标识码：A文章编号：1007―3612(2007)03―0404―03

现代推铅球技术是在投掷圈内从静止姿势背对投掷方向开始，通过滑步或旋转后将铅球推出的过程。铅球的飞行远度主要是由铅球的出手速度、出手角度和出手高度决定的，其中出手速度起着决定作用，而铅球的出手速度又是身体各环节协调用力的结果，因此研究投掷过程中人体各环节和铅球的速度变化特征，找出其内在规律，对指导教学与训练有着重要的现实意义。

1研究对象与方法

1.1研究方法以参加2006年全国田径大奖赛肇庆站男子铅球比赛的冠军庞侨韬琳(以下简称庞)和广州体育学院运动员李富(以下简称李)为研究对象，二人均为右手持球，采用背向滑步推铅球技术，其中庞的身高188cm，体重115kg，本次比赛最好成绩17.02m，李的身高193cm，体重115kg，本次比赛最好成绩14.13m。

1.2研究方法

1.2.1影像解析法采用日本NAC牌高速摄像机在比赛现场从投掷方向正侧面进行平面定点定焦拍摄，拍摄频率为250帧，s，拍摄距离为12m，机高1.2m，比赛后拍摄标尺完整图像，采用APASSystem对运动员的最好成绩进行图像解析，对采集的数据使用数字滤波法进行数据平滑。

1.2.2文献资料法本研究从中国期刊网上搜索查寻了13种体育类核心期刊(从1994―2005年)、中国期刊全文数据库(从1980―1993年)以及中国优秀博硕士学位论文全文数据库中有关铅球训练与技术分析的文献50余篇，并进行了分析研究。

为了便于分析，本文将推铅球的技术动作分为四个时相：滑步开始右脚离地瞬间(t1)、滑步结束右脚着地瞬间(t2)、左脚着地瞬间(t3)、铅球出手瞬间(t4)，其中可分为三个阶段：滑步阶段(t1―t2)、过渡阶段(t2―t3)、最后用力阶段(t3―t4)。

2结果与分析

在本次比赛中，庞在推出17.02m的成绩时，铅球的出手速度为12.40m/s，出手角度为40.60，出手高度为2.47m。李在推出14.13m的成绩时，铅球的出手速度为10.80m/s，出手角度为37.3°，出手高度为2.54m。

2.1人体重心和铅球重心速度的变化在图1和图2中给出的分别是两名运动员从t1至t4时相人体重心的速度和铅球的速度，其中曲线上第一个涂黑的标志点的时间为t2，第二个标志点的时间为t3，由于李的t3出现在t2之前0.008s，故没有标出。从图1中可以看出，庞和李两人的身体重心速度在腾空阶段出现明显下降，但在t2时刻前又有所上升，但李的上升幅度更大，经查看图像，是由于李的躯干抬起幅度较大所致，这对于保持超越器械和工作距离是不利的。在图1中，庞的身体重心速度在t2―t3时段内略有下降，在t3之后即有较大的上升，持续时间达0.036s，说明身体有向前上方的加速运动，随之身体重心的速度大幅度的快速下降，说明左腿制动性的支撑动作强而有力。与庞有所不同的是，李的左脚在右脚着地前0.008s时着地(这在优秀运动员中极为罕见)，尽管落地速度较快，但在较长时间内身体重心的速度持续下降，没有出现向前上方的加速运动，说明李的双腿没有及时发力，较长时间处于缓冲阶段，这对于髋部的及时加速和利用滑步的速度显然是不利的，也说明左脚过早着地并一定能提高用力的效果。

从图2中可以看出，李的铅球速度在双脚着地后有所下降，虽然速度上升的拐点出现较早，但速度增长的持续时间较短，在铅球出手前，铅球的速度增加较缓，经过观察录像可知，主要是因为李的用力顺序不正确，躯干过早转向投掷方向运动所致。虽然庞的铅球速度增长拐点出现较晚，但持续增长的时间较长，最后达到了较大的出手速度。

2.2身体右侧环节的速度变化在图3和图4中显示的是庞和李从左脚落地瞬间至铅球出手瞬间身体右侧环节的速度变化，并可间接反映有关环节的肌群的用力情况。从图3中可见庞的右髋先加速达到峰值，随后其速度逐渐下降，然后是右肩、右肘和右腕速度快速上升同时达到峰值，其后是右手的速度达到峰值，在O.040s之后铅球的速度达到峰值，这是值得注意的。从图4中可以看出，李在最后用力过程中肘关节的速度峰值再现在肩关节的速度峰值之前，因而其速度的增量不大，影响了投掷效果，也不符合人体运动链自下而上逐渐加速进行动量传递的原理，是一个错误的动作。

为了详细分析庞李两人在最后用力时身体各环节速度变化情况，在图5中画出了他们两人自左脚落地瞬间至铅球出手瞬间胸部的速度曲线。

从图5中可以看出，李在左脚落地后胸部即有较高的速度，但随即速度下降至较低水平，庞的胸部速度峰值出现稍晚，存在‘延迟用力’的现象，但却达到了较大的速度峰值。这。说明在左脚落地后胸部过早加速不但不会提高最后的铅球出手速度和增加用力效果，反而会破坏用力的结构，给最后用力带来负面影响。从图5中还可见到，两人的胸部速度曲线都存在双峰型的情况，而且第一峰值速度大于第二峰值。庞的胸部速度曲线出现了时间短而峰值高的特征，李的曲线延续时间较长但较低平。两人胸部速度曲线说明，他们的躯干动作有很大区别：庞的躯干动作表现为以髋部为起点的鞭打动作，时间短而增速快，在动作之后速度急速下降；李的胸部动作时间长，增速少而慢，鞭打动作特性表现不突出。

为了详细观察两名运动员的身体环节速度变化情况，按顺序列出了两人投掷时身体环节的峰值速度和出现时间。从表中可见，运动员肩关节的峰值速度比髋关节的峰值速度增加了一倍以上，肘关节的峰值速度比肩关节的峰值速度也有较大增加，但腕关节的峰值速度与肘关节的差异很小，手的峰值速度比腕的速度有所增加，铅球的峰值速度与手的峰值速度相比略有增加而且时间稍迟。

庞、李的身体环节峰值速度基本上呈现出依次递增的规律，其中庞在肘关节处的速度增量最大，增幅达到5.0m/s，李的肩关节速度增量最大，增幅达到4.5m/s，且其肩的峰值速度明显大于庞的峰值速度；经观察比赛录像得知，李在最后用力的过程中，躯干向前的幅度较大，时间较长，使处于躯干上端的右肩的速度增加明显，但由于肩带肌肉未能及时发力使上臂前伸，影响了肘关节的速度，并最终影响了铅球的出手速度。

对两位选手最后用力时身体主要环节峰值速度的大小和出现的时间进行分析，表明上述参数可以作为评价推铅球最后用力效果的具体指标。为了更详细的了解身体各环节速度变化的基本规律，我们以最后用力时髋关节的峰值速度为基准点，自下而上算出身体其它环节和铅球峰值速度的增加比例，按下列公式将之换算成为环节峰值速度递增系数，具体计算公式如下：

环节峰值速度递增系数＝(Vmax2－Vmax1)/Vmax1×100％

其中Vmax1表示前一个环节的峰值速度，Vmax2表示该环节的峰值速度。

3结论与建议

1)水平较高的铅球运动员身体重心速度在过渡阶段呈现出基本保持或略有下降的态势，在最后用力阶段的开始较短时间内快速上升，随即快速大幅度下降。

2)铅球运动员推铅球时，按照自下而上的用力顺序和一定的时间间隔进行投掷，但庞在投掷时呈现出胸部和右肩、右肘的峰值速度在左脚落地后0.184s同时出现的特点，腕关节和肘关节的峰值速度相比差别很小，未出现加速现象，但出现时间稍晚，两名运动员的手的峰值速度比腕和肘关节增加了10％以上。

分子生物学技术篇5

关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应

20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点[1]。因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。

1材料

仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。

2方法

2.1标本采集和处理

2.1.1标本的采集和液化

用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。痰液收集后应尽快送检。在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。

2.1.21×TE溶液配制

吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。

2.1.3标本及质控标准品的处理

取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。(血液标本直接用淋巴细胞分离液分离沉淀白细胞)沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,沸水浴10分钟(误差不超过1分钟),转至4°C静置6～8小时以保证充分裂解。1000rpm离心5分钟,取上清液2ul做核酸扩增反应。另取阴性质控品、阳性质控品各40ul加等量DNA提取液打匀,沸水浴10分钟后同上处理。

2.2加样

将样品处理上清液各2ul分别加入反应管中,混匀后置核酸扩增仪上,立即进行PCR扩增反应。

2.3核酸扩增程序

93°C2分钟预变性,然后按95°C45秒55°C60秒,先做10个循环,最后按93°C30秒55°C45秒,做30个循环。

2.4结果分析

在定量分析中,综合考虑相关系数,误差后,设置当前域值(参考值1.2左右)。

3结果判断

Ct值无:阴性结果;Ct值

4质量控制

阴性质控品:全部阴性;阳性质控品(包括临界阳性质控品、强阳性质控品)全部阳性;阴性质控品Ct值>临界阳性质控标准品Ct>强阳性质控标准品Ct,则本次实验有效,否则,实验无效,应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。

5讨论

结核杆菌(TB)可以导致全身性疾病,特别是在发展中国家,其发病率较高,危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大,对抗痨药物的耐药性增加[2],从而使结核病的发病大幅度增高。虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断,但对某些病人亦可造成误诊或漏诊.分子生物学技术基本实现了简便、快速、防污染、灵敏、准确地诊断结核的目的[3],并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室[4]。应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的,且是结核杆菌的保守序列,这样才能保证检测结果的特异性[5]。自从1989年聚合酶链反应(PCR)应用于结核杆菌检测以来,该技术已广泛应用于结核病的诊断并显示出很多优点.PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围,PCR检测TB的优点主要表现如下:

5.1能早期诊断TB菌血症

在TB感染的早期,特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时,PCR就能给于扩增并确诊.此外,由于外周血中TB的含量甚微,又没有新的病灶形成,因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的,而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义,因为早期菌血症是较易控制的,并可以防止继发性TB病灶的形成。

5.2时间短

PCR检测TB仅需2～4h对于某些培养法难以实施的病例,PCR法则行之有效,同时提高了敏感性和特异性,可以检测到1个TB菌。

5.3有利于鉴别诊断

对于肺结核来说,其中的结核球和成人型原发性结核等,经常易于同肺癌的诊断相混淆。病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的。在这种情况下,PCR检测就显得特别有效。在许多情况下,TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等。涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点,但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值。PCR检测这类标本,可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水。另外,对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断,PCR都可以予以完成。

5.4抗痨治疗的评价

对于抗痨治疗效果的评价,以前的方法显得软弱无力。而PCR法则可以通过定期检测,采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度。PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标。

所以分子生物学技术聚合酶链反应对于评估结核病的临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义。随着人们对结核分枝杆菌的认识不断深入,结核病临床发展的需要,我们必须从菌体水平到分子水平,从传统实验方法到现代实验方法,进行全视角全方位的研究和探索,为达到最终控制结核病提供理想手段。

参考文献

[1]庄玉辉.加强结核病实验诊断技术的临床应用研究.中华检验医学杂志,2001,24:69-70.

[2]勒小红、刘元东、苗青。结核分枝杆菌耐药基因突变的研究。中华检验医学杂志,2004。27:117-117.

[3]EnglundS.BolskeG,Ballagi-pordnyA,etal,DetectionofMycobacteriumaviumSubsp.patatuberculosisintissuesamplebysingle.fluorescentandnestedPCRbasedontheIS9100gene.VetMicrobiol,2001,81:257-271.