药品微生物研究篇1

[关键词]微透析；探针回收率；丹皮酚；胡椒碱；丁香酚

Invitroandinvivorecoveriesofcutaneousmicrodialysisprobeofpaeonol，eugenolandpiperine

YANGChang，BAIJie*，DUShouying*，CUIYahua，ZhangQinshuai，MaJunming

（BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China）

[Abstract]Toestablishamethodfordetectingmicrodialysisrecoveryofpaeonol，eugenolandpiperineinHuoxueZhitongpatch，inordertoprovidethebasisforfurtherpercutaneouspharmacokineticsstudies.Theconcentrationsofpaeonol，eugenolandpiperineindialysatesweredeterminedbyHPLC，andprobedeliverieswerecalculatedrespectively.Theeffectsofconcentrationandcalibrationapproachesonthemicrodialysisprobedeliveriesofthethreecomponentswereinvestigated，andtheirprobeabsorbability，invitroandinvivoprobestabilityandrepeatabilitywerealsostudied.Theresultsindicatedthatlittlepaeonol，eugenolandpiperinewereobservedinprobeswith30%alcoholastheperfusate，andcouldbecleanedfromprobeinashorttime.Andtheinvivoandinvitroprobedeliveriesofthreecomponentswerestablewithin8h，drugcontainingsolutionandblankperfusatewerealternativelyusedforthreetimes，andtheinvivoandinvitroprobedeliveriesofthreecomponentswerebasicallyunchanged.Theinvitrorecoveriesofpaeonol，eugenolandpiperinewitharangeofconcentrationwererespectively（45.7±4.66）%，（27.82±2.95）%，（41.3±3.96）%，whichindicatednoconcentrationindependent.Underthesameconditions，thesimilardeliverywasobservedbydialysis，retrodialysisandnonetflux.Therefore，theconcentrationsofanalysesofthecollectedfractioncouldbecalibratedbyinvitroorinvivorecoveries.Meanwhile，thisalsoprovedthatthemicrodialysismethodbuiltbythisstudyisapplicabletothestudyonpercutaneouspharmacokineticsofHuoxueZhitongpatch.

[Keywords]microdialysis；probedelivery；paeonol；eugenol；piperine

doi：10.4268/cjcmm20162226

活血止痛膏应用历史悠久，能够活血止痛、舒筋通络，临床上广泛用于筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、关节疼痛等的治疗。其中牡丹皮PaeoniasuffruticosaAndr.为方中君药，与当归、川芎等配伍能够活血化瘀止痛，胡椒PipernigrwmL.，丁香EugeniacaryophyllataThunb.等辛温之品，加强散寒止痛之功。丹皮酚（paeonol，Pae）、丁香酚（eugenol，Eug）和胡椒碱（piperine，Pip）分别是牡丹皮、丁香和胡椒的主要活性成分，均为活血止痛膏中的有效成分[1]。通过检测局部给药后有效成分的吸收，来判断在一定时间内组织、器官中药物的浓度是否达到治疗量，可以指导经皮药用辅料、载药体系及给药方法的优选及应用。

本研究建立丹皮酚、丁香酚、胡椒碱体内外微透析回收率的测定方法，考察将微透析技术应用于活血止痛膏经皮药动学研究的可行性，为活血止痛膏经皮药动学评价提供依据。

1材料

Waterse2695高效液相色谱仪（2998PDA检测器，四元梯度泵，控温自动进样器，柱温箱，溶剂脱气机，Empower工作站）；DiamonsilC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；微透析系统，包括Pump11Elite型微量注射泵（HARVARDAPPARTUS），2.5mL玻璃注射器（Hamilton），CMA30线性微透析探针（CMA，半透膜长度为1cm，截留相对分子质量6000）；KQ5200DA数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；1mL一次性注射器（常州悦康医疗器材有限公司）；津腾尼龙66孔径0.45μm微孔滤膜；TK20B型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；MP5002型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

丹皮酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110708201407）；丁香酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110725201414）；胡椒碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号110775201405）；丹皮酚药品（成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制，批号MUST15020401）；丁香酚药品（SigmaAldrich公司，批号STBC6086V）；胡椒碱药品（成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制，批号MUST15071310）。甲醇（Fisher公司，色谱纯）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；乙酸（Fisher公司，色谱纯）；无水乙醇（北京化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1透析液中Pae，Eug及Pip含量测定方法的建立

2.1.1色谱条件与系统适用性DiamonsilC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相甲醇酸水（乙酸调节pH至2.8），梯度洗脱，洗脱梯度见表1，流速1.0mL・min-1；检测波长Pae274nm，Eug280nm，Pip343nm[1]；进样量10μL；柱温30℃。

2.1.2对照溶液的制备精密称定Pae对照品5.41mg，Pip对照品5.11mg，Eug对照品54.38mg于10mL量瓶中，用无水乙醇超声溶解并稀释至刻度，配成质量浓度分别为541，511，5438mg・L-1的对照品储备液。将各对照品储备液用30%乙醇溶液稀释，分别得到低（Pae，Eug，Pip质量浓度分别为2.45，6.45，1.42mg・L-1）、中（Pae，Eug，Pip质量浓度分别为12.75，35.20，13.50mg・L-1）、高（Pae，Eug，Pip质量浓度分别为53.64，96.10，32.14mg・L-1）的对照品溶液。

2.1.3方法的专属性将空白灌流液，Pae，Eug，Pip混合对照品溶液，以及透析液样品注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下，Pae，Eug，Pip的峰形良好，无杂质峰干扰，对称因子、理论塔板数、分离度均符合要求，说明本方法具有较好的专属性，见图1。

2.1.4标准曲线的绘制精密移取一定量的对照品储备液，以30%乙醇

分别稀释成不同浓度的混合对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件检测，以待测成分质量浓度C（mg・L-1）为横坐标，以待测成分峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得到Pae，Eug，Pip的标准曲线。Pae在0.8656～108.2mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=52868C-23645，r=0.9996；Eug在0.8524～106.55mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=9705.7C-5303.9，r=0.9995；Pip在0.8176～102.2mg・L-1线性关系良好，标准曲线回归方程为A=70932C-38598，r=0.9992。

2.1.5稳定性试验分别取低、中、高3种浓度Pae，Eug，Pip混合30%乙醇溶液于2，4，6，8，10，12，24h进样，测定3种成分的峰面积，计算RSD。Pae从低浓度到高浓度RSD分别为1.2%，0.62%，0.34%；Eug从低浓度到高浓度RSD分别为1.6%，0.53%，0.35%；Pip从低浓度到高浓度RSD分别为1.1%，0.48%，0.36%，说明在此条件下，3种成分24h内稳定性良好。

2.1.6精密度试验分别取低、中、高浓度的Pae，Eug，Pip混合30%乙醇溶液，按2.1.1项下的色谱条件在1d内各连续进样3次，记录峰面积，计算RSD。Pae从低浓度到高浓度RSD分别为2.3%，0.37%，1.3%；Eug从低浓度到高浓度RSD分别为0.65%，0.80%，1.2%；Pip从低浓度到高浓度RSD分别为2.0%，0.57%，1.3%，说明在此条件下，该仪器精密度良好。

2.2线性微透析探针体外回收率方法的建立

2.2.1透析法将线性探针有效渗析窗完全浸没在空白灌流液中，持续加热搅拌[（32.5±0.2）℃，350r・min-1][2]。用空白灌流液灌流探针1h，流速1.5μL・min-1。随后将透皮池内溶液换成含一定浓度药物的溶液，继续灌流，每20min收集1次微透析样品（每次30μL）。

2.2.2反透析法将线性探针有效渗析窗完全浸没在空白灌流液中，持续加热搅拌[（32.5±0.2）℃，350r・min-1]。用空白灌流液灌流探针1h，流速1.5μL・min-1。随后用上述相同浓度药液灌流探针，每20min收集1次微透析样品（每次30μL）。

2.2.3探针吸附性考察[3]分别采用透析法和反透析法考察探针吸附性，收集6次微透析样品后，将含药溶液换成空白灌流液，继续灌流，间隔20min，共收集12次微透析样品，用HPLC测定样品中药物含量。以取样时间为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制吸附率时间曲线（吸附率=该点透析液浓度/各时间点透析液最高浓度×100%）。Pae，Eug，Pip在30%乙醇生理盐水作为灌流液的条件下，微透析探针吸附率随时间的变化见图2。

虚线处为将灌流液由含药溶液更换为空白灌流液时间；A.透析法；B.反透析法（图3同）。

从图2可以看出，当探针外Pae，Eug，Pip浓度高于探针内部时，将药液更换成空白溶剂后，透析液中3种成分的浓度迅速降低，20min后Pae，Eug，Pip的吸附率分别为9%，4%，13%，从探针上完全洗脱下来的时间分别为40，20，60min；当探针外Pae，Eug，Pip浓度低于探针内部时，将药液更换成空白溶剂后，透析液中3种成分的浓度迅速降低，40min后Pae，Eug，Pip的吸附率分别为11.5%，7.3%，12.8%，从探针上完全洗脱下来的时间分别为60，40，80min。

2.2.4探针日内稳定性考察[5]分别采用透析法和反透析法，连续收集样品480min，利用HPLC测定透析液中药物浓度，计算探针的回收率，考察线性探针在480min内回收率的稳定性。Pae，Eug，Pip在体外微透析环境下，探针稳定性见图3。

由图可知，在8h内，透析法测得的Pae，Eug，Pip的微透析探针回收率分别为（40.93±0.68）%，（32.07±2.29）%，（22.91±1.20）%；反透析法测得Pae，Eug，Pip的微透析探针回收率分别为（36.9±2.33）%，（32.84±1.97）%，（38.52±2.61）%，3种成分在测定时间内探针体内外回收率均能保持稳定。

2.2.5探针日内重复性考察[5]采用透析法测定探针的日内重复性，收集6次样品后将含药溶液换成空白灌流液，继续用空白灌流液灌流，收集6次透析样品；重复上述步骤3次。利用HPLC测定透析液中的药物浓度，按透析法计算微透析探针的回收率，见图4，Pae，Eug，Pip线性微透析探针的日内回收率分别为（40.52±0.45）%，（33.84±0.51）%，（25.96±2.42）%，日内重复性良好。

2.2.6药物浓度对探针体外回收率的影响[5]采用反透析法考察浓度对探针回收率的影响，用一系列含有不同浓度Pae，Eug，Pip的混合溶液灌流探针，流速1.5μL・min-1，每20min收集1次微透析样品（每次30μL），收集6次。每次更换灌注液前需用灌注液平衡1h。利用HPLC测定透析液中药物浓度，分别绘制浓度回收率曲线，见图5。由结果可知，Pae，Eug，Pip的回收率分别为（45.7±

2.2.7校正方法对探针回收率的影响[7]采用反透析法测定校正方法对探针回收率的影响，以一系列含不同浓度Pae，Eug，Pip的灌流液进行灌注，灌注液浓度见表2。每次更换灌注液前需用空白灌注液平衡1h，每20min收集1次样品，重复收集6次。利用HPLC测定透析液中药物浓度，以渗析液（Cd）和灌注液（Cp）中药物浓度差（即渗析液中药物浓度的净增加值）对灌注液中的药物浓度作图，直线与横轴交点处的浓度即为探针周围浓度中药物的浓度，直线的斜率为探针的回收率，方程拟合结果见表3。

2.3线性微透析探针在体回收率方法的建立

2.3.1微透析探针的植入[7]取SD大鼠[5周龄，（200±10）g]，用0.2g・mL-1乌拉坦按体重（1.5g・kg-1，ip）麻醉后，固定于鼠板上，小心剃去腹部毛发；利用引导针穿刺将微透析探针（半透膜长度为10mm）植入大鼠皮下后，将引导针小心抽回，微透析探针膜留于大鼠皮下组织中；在样品收集前用空白灌流液排除探针内气泡，并以1.5μL・min-1灌注速率平衡1h，以修复组织损伤，用红外灯给大鼠取暖。

2.3.2微透析探针在体回收率稳定性考察[4]线性微透析探针植入后，用空白灌流液平衡1h后，用含有一定浓度Pae，Eug，Pip混合溶液灌流探针，流速1.5mg・L-1，每20min收集1次微透析样品（每次30μL），收集480min，利用HPLC测定透析液中药物浓度，按反透析法测定探针的回收率，考察线性探针在体回收率480min内的稳定性，结果见图6。

由图所知，Pae微透析探针在480min内的在体回收率保持在（46.80±1.66）%，Eug为（45.06±1.66）%，Pip为（34.15±2.06）%，表明在480min内3种成分微透析探针的在体回收率稳定。

2.3.3微透析探针在体回收率重复性考察[5]线性微透析探针植入后，交替用一定浓度Pae，Eug，Pip混合溶液和空白灌流液灌流探针，流速1.5mg・L-1。样品收集前平衡1h，每20min收集1次微透析样品（每次30μL），重复收集6次后用空白灌流液灌流1h，交替3次。利用HPLC测定透析液中药物的浓度，按反透析法计算探针的回收率，考察探针回收率在体日内重复性。Pae，Eug，Pip线性微透析探针的在体回收率分别为（45.79±1.89）%，（44.00±1.52）%，（35.83±2.38）%，日内重复性良好。

3讨论

活血止痛膏是安徽安科余良卿药业有限公司自主研发的一种橡胶膏剂，年销售额过亿元，为国家医保目录品种、国家中药保护品种，现收载于2015年版《中国药典》第一部[1]。其处方主要由干姜、山柰、丁香、陈皮、牡丹皮、没药、乳香、胡椒、樟脑、冰片等20多味药组成，虽已有文献对其透皮性能进行报道，但对其有效成分的体内过程却鲜有研究。

微透析技术[1011]是应用于经皮药动学研究的重要方法。由于灌流液的不断流动，所测得的药物浓度为探针植入部位药物实际浓度的一部分，所以探针回收率校正是微透析技术应用于经皮药动学研究的前提。鉴于此，本研究以Pae，Eug，Pip为指标，建立活血止痛膏经皮微透析体内外回收率测定方法，考察微透析技术应用于活血止痛膏经皮药动学研究的可行性，为其体内药动学的研究、基质优选以及制备工艺优化提供理论依据。由结果可知，体内局部药物浓度可以用体外或体内测得的回收率进行校正，微透析技术用于活血止痛膏的经皮药动学研究是可行的。

微透析探针对脂溶性成分具有一定的吸附性，导致探针体内外回收率较低[4]。本课题组前期对灌流液进行了筛选，由于渗透压和避免探针的吸附性不可兼得，为保证后续试验的顺利进行，本研究选择探针吸附性最小的30%乙醇生理盐水为灌流液。从吸附性试验结果可以看出，以30%乙醇生理盐水为灌流液，探针对Pae和Eug无明显吸附，对Pip略有吸附，3种成分在探针上均不存在死吸附现象，短时间内均可被灌流液洗脱下来。

在微透析探针体外回收率研究中，透析膜两侧溶剂相同，渗透压相同；而在体内试验中，由于30%乙醇溶液渗透压高于体液，使得灌流液中成分更多地进入组织细胞中，流出液浓度减小，导致本研究中所测的在体回收率与体外回收率有较大差别，胡椒碱的结果尤其如此。多数研究[1011]常用反透析法测得的微透析探针体内回收率来校正所测得的局部药物浓度，本课题组后续将比较不同剂型的体内药动学差异，用体外所测得的回收率或者反透析测得的回收率进行浓度校正对结果没有较大影响，因此，两者均可用于采集部位的浓度校正。

[参考文献]

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[4]SasongkoL，WilliamsKM，RamzanI，etal.Assessmentofinvitroandinvivorecoveryofgallamineusingmicrodialysis[J].JPharmacolToxicolMethods，2000，44（3）：519.

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药品微生物研究篇2

关键词：活体微生物农药；果树虫害；杀虫剂

长期以来，为了保证果树的高产、稳产，生产上普遍使用化学农药防治病虫害。但是化学农药存在着污染环境、使害虫产生耐药性等诸多无法克服的弊端。在人们日益重视环境与食品安全的今天，微生物农药以生产工艺较简单、开发费用较低、对人畜安全、无农药残留、害虫不产生抗药性、不污染环境的优势越来越受到广泛的关注与应用。因此，近年来国内外都在积极地开发研制各种有效的微生物农药。

微生物农药是生物农药的一类，是能够用来杀虫、灭菌、除草以及调节植物生长等的微生物的活体或代谢产物，包括农用抗生素和活体微生物农药。活体微生物农药是将能使有害生物致病的病原微生物活体通过工业方法大量繁殖，并加工成制剂后作为农药使用。现对活体微生物肥在果树上的应用作一综述与展望，供大家参考。

1、果树上常用的活体微生物农药

1.1细菌杀虫剂

细菌杀虫剂是利用某些对昆虫有致病或致死作用的细菌及其所含有的活性成分制成。其作用机制是胃毒作用，昆虫摄人该病原细菌制剂后，通过肠细胞吸收，进人体腔和血液，使之得败血症导致全身中毒死亡。

目前筛选的杀虫细菌大约有100多种，其中被普遍开发应用的有苏云金芽孢杆菌、日本金龟子芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌等。研究开发最为成功的是苏云金芽孢杆菌，目前已广泛应用于农作物、森林、粮仓害虫和蚊蝇等的防治。其中苏云金芽孢杆菌是世界上用途最广、产量最大、应用最成功的微生物杀虫剂。该制剂占微生物杀虫剂总量的95％以上，已有多个国家登记了120多个品种，而且用于防治苹果小卷叶蛾、桃小食心虫及刺蛾等鳞翅目果树害虫，效果良好。

1.2真菌杀虫剂

真菌杀虫剂是一类寄生谱较广的昆虫病原真菌，是一类触杀性微生物杀虫剂。目前，研究利用的主要种类有白僵菌杀虫剂、绿僵菌杀虫剂、拟青霉杀虫剂及座壳孢菌杀虫剂。迄今为止，全世界记载的杀虫真菌约有100多个属，800多个种。其中研究最多的是白僵菌，其次是绿僵菌。此外还有拟青霉属、赤僵菌、虫生藻菌等；英国、美国等国家还生产出蚧生轮枝菌及汤普森多毛菌的商品制剂。在果树害虫生物防治中常用的是球孢白僵菌、绿僵菌、座壳孢霉、汤普森被毛孢及蚜虫霉。白僵菌孢子同石硫合剂等混喷时防治苹果树靳氏苔螨效果好。利用绿僵菌防治苹果桃小食心虫，在实验室和田间都取得良好效果。

1.3病毒杀虫剂

病毒杀虫剂是一类以昆虫为寄主的病毒类群，虽研究开发较晚，但以其高度的专一寄生性及持效作用长等优点在近年来得以发展迅速。但使用病毒杀虫剂也有一定缺点，如宿主范围窄，施用效果易受外界环境影响等。

目前，研究较多且应用较为普遍的有核形多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(GV)及质形多角体病毒(CPV)。核形多角体病毒主要用于农业和林业等害虫的防治，颗粒体病毒主要用于防治菜青虫、小菜蛾及黄地老虎等。近年来，我国已有20多种病毒杀虫剂进入了大田试验。但目前在果树害虫防治上的昆虫病毒较少。

1.4微孢子虫杀虫剂

微孢子虫属于原生动物，具有一条极丝和一团孢子原生质。其孢子被昆虫吞食进入肠道，通过外翻极丝而引起感染。从而引起宿主活力丧失、行为变化、交配减少或卵率降低并致其死亡。目前，普遍用于农林防治的微孢子虫杀虫剂有蝗虫微孢子虫、行军虫微孢子及云杉卷叶蛾微孢子虫。1986年北京农业大学从美国引进的蝗虫微孢子虫(Nosemalocstae)在防治草原蝗虫方面取得了显著效果，它既能在短时间内迅速降低虫口密度，又能引起流行病，达到长期防治的目的。

1.5线虫杀虫剂

线虫是目前国际上新型的生物杀虫剂。刘新生等报道，夜蛾斯氏线虫对梨象鼻虫幼虫有很高的侵染力。刘奇志等用苹果蠢蛾线虫Agriotose品系及Mex2kapow品系防治杏园桃红颈天牛，施用1个月的效果达72.2％以上。用苹果蠢蛾线虫防治龟背天牛、荔枝拟木蠢蛾均具有明显防治效果。目前，研究最多且应用最有效的为索科线虫和斯氏线虫科。

药品微生物研究篇3

关键词:中草药生物转化工程;微生物工程;酶工程;生物中药

中图分类号:R932文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0001-04

随着中医药现代化战略的逐步推行,中医药发展正迎来新的挑战与机遇。中国科学院院士王夔在为《中药成分代谢分析》作序时指出:“近年来中药现代化研究基本上是以产品为目标,以新中药制剂开发为目的。开发有余,而研究不足。实际上,中药现代化的根本是中药学现代化。中药产品的现代化可以栽培现代化、质检和质量标准现代化、工艺现代化等等方面下功夫,执行GAP、GLP、GEP、GMP、GCP等标准。但是,即使如此开发的中成药仍然在世界药学中不能占有举足轻重的地位;接受这些产品的绝大多数是华人。我们必须强调中药的现代化要以中药学现代化为基础;也就是中药学要用世界自然科学和医学科学能够接受的概念和理论来阐述。”[1]要中医药现代化,首先是中医药理论的现代化,再是中医药产业的现代化。笔者认为,在探索中国古典哲学、中医药理论、现代科学技术与现代科学方法论、现代人体生命科学理论等相互结合的基础上,推动中医理论的科学化、现代化,并在现代中医理论的指导下进行中药现代化研究及其创新的研发[2]。

在总结古今传统中药和方剂中涉及生物转化原理的基础上,从中药成分代谢分析中探析,结合化学成分组学、基因组学、蛋白组学、代谢组学、糖生物学、系统生物学、药物设计学、高通量筛选技术等现代生命科学技术,运用生物转化技术,尤其是运用体外生物转化技术改善中药制剂的疗效与个体差异,提出了新的中医药产业工程――中草药生物转化工程,以及相应的创新中药――生物中药。中草药生物转化工程是将酶工程、微生物工程、代谢工程、基因工程、糖生物工程、药物设计工程、生物信息学等现代生物工程技术合理运用到中医药现代化研究中,合理继承传统中医药理论,对中医药进行创新与传承,并开发出相应的生物中药。中草药生物转化工程的两个主要研究内容:微生物转化与创新中药、酶法转化与创新中药。

1微生物转化与创新中药

1.1微生物发酵与传统中药

在研究中华医药史中著名中草药及方剂的过程中发现,利用微生物技术制备传统中药有着悠久的历史。“酒为百药之长”,具有通血脉、行药势等功效,原始的酿酒技术产生于4000多年前的夏禹时代,酒是酵母发酵的产物,是细胞内酶作用的结果[3]。约3000年前,利用麦曲含有的淀粉酶将淀粉降解为麦芽糖,制得具有缓中、补虚、生津、润燥功效的饴糖。在长沙马王堆汉墓出土的帛书《五十二病方》中记载了用于治病的粪便类中药,实际上是宿主与其消化道内的厌氧微生物共同代谢与发酵产生的混合物。公元10世纪左右,我国有了豆酱制品,及由此工艺衍化制备出的用于解肌发表和宣郁除烦的淡豆豉,豆酱和淡豆豉均是微生物的发酵产物。三国时期的著名医学家华佗创造了制备金汁的秘法,即利用刮青竹筒(天然膜管)从粪窖内人源性微生物与自然界微生物混合深层发酵产物中提取而得[4]。首载于元代《饮膳正要》中的红曲,为微生物红曲霉发酵梗米加工品而产生的发酵物,具有健脾消食、活血化瘀等功效[5]。我国是最早利用真菌防病治病的国家,早在《神农本草经》中,就有灵芝、茯苓、猪苓、雷丸等药用真菌的记载[6],现仍广泛应用。真菌具有分解纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等营养物质的强大酶系,对天然培养基有较强的分解利用能力,具有种类多、次生代谢产物多、培养条件简单等特点,成为微生物发酵炮制或制备传统中药的主要功能菌。利用古老中药中寄生真菌自身发酵的研究已成为现在研究的热点,如灵芝、冬虫夏草、云芝、灰树花、茯苓、麦角菌等都有大量的研究报道[6]。

微生物发酵是传统中药中的一种重要炮制方法。我国人民将微生物发酵应用于中药炮制,即将药材与辅料拌和,在一定温度和湿度下,通过微生物的生物转化作用达到提高药效、改变药性、降低毒副作用等目的[6]。《中华人民共和国国家药品标准》中收录的19种曲药,如,配方和工艺均绝密的片仔癀、六神曲、建曲、采云曲、霞天曲、黔曲、半夏曲、老范志万应曲、泉州百草曲、沉香曲等,均是微生物固态发酵而成的中药。不同培养基经同样微生物处理后会产生不同的药性,可利用该特性生产具有不同适应证的中药。例如,发酵淡豆豉时,以桑叶、青蒿发酵者,药性偏于寒凉,多用于风热感冒或热病胸中烦闷之症;以麻黄、紫苏发酵者,药性偏于辛温,多用于风寒感冒头痛之症[7]。

微生物发酵代谢产物是传统中药方剂配伍中的一类重要中药。除目前仍在方剂配伍中广泛使用的曲药外,粪便类中药作为微生物发酵代谢产物也被古今许多医家用于传统方剂配伍中,如《五十二病方》、《黄帝内经》、《中华人民共和国药品标准•中药成方制剂》等均有记载[8],最为著名的方剂有失笑散、温病方剂神犀丹及三石汤等。在利用粪便类中药配伍方剂治病方面,尤其值得一提的是清朝的著名温病学家叶天士,他善于运用金汁配伍于方剂中治病救人,在黄英志主编的《明清名医全书大成•叶天士医学全书》中含“金汁”的临床处方和方剂近100处之多,其中包括著名的温病灵丹神犀丹。

1.2微生物转化中药成分

微生物转化中药成分的研究始于20世纪90年代初,日本的小桥恭一发现中草药成分如番泻苷,可借助肠道细菌转化为致泻有效成分,随后他的课题组对系列糖苷类化合物如黄芩苷、汉黄芩苷、人参皂苷等进行了研究,指出糖苷类化合物为天然前药[9]。基本原理是利用微生物细胞产生的一种或多种酶把中药中的一些化学成分转化成结构相关的更有经济价值的产物,来完成常规化学方法难以实现的生化反应,其本质是利用微生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应,改变药物原有性能,产生新的功能作用,或增强原有的功能活性。如口服人参皂苷类成分的肠内微生物转化[10]。

将微生物工程技术应用于中药创新,将是中药创新研发中的新热点,其主要特点可概括如下[2]:①药物的有效组分、活性成分最大限度地得以提取、利用;②药物进入人体后不能直接被利用的有效活性组分,可在体外生物转化而被直接利用,将高极性中药成分转化为低极性成分,改善了药物的脂溶性,使其功效迅速发挥;③可以提高中药制剂的普适性,肠道微生态菌群因个体存在很大的差异性,结果引起药物的生物利用和功能作用差异明显,而通过体外生物转化可避免之,从而提高其普适性;④微生物转化后与原有药物相比产生了新的活性物质,从而可能产生新的保健、治疗或预防等功能作用;⑤其具有生产工艺可控、所得产物明确、制剂方便、便于与国际接轨等优点,因而是实现中医药现代化战略的有效途径。

2酶工程与创新中药

酶作为生物催化剂,在许多化学反应中具有不可低估的作用,作为生物进化的高级形式,与一般的化学催化剂相比,它可以在非常温和的条件下高效、专一性地催化底物转变为产物,具有广阔的应用前景。酶是由细胞产生的具有催化能力的物质,其化学本质主要为蛋白质,少数酶同时含有少量的糖和脂肪,也有少数是核酸等其它物质。酶大部分位于细胞内,部分分泌到体外。新陈代谢是生命活动的最重要特征,一切生命活动都是由代谢的正常运转来维持的,而生物体代谢中的各种化学反应都是在酶的作用下进行的。酶是促进一切代谢反应的物质,没有酶,代谢就会停止,生命也即停止。酶工程技术是现代生物技术的重要组成部分,其特点是利用生物酶、含酶细胞器或细胞(微生物、植物、动物)作为生物催化剂来完成某些重要的化学反应,应用范围包括医药、食品、化学工业,诊断分析、检测分析和生物传感器等。在中药创新研发过程中,酶工程技术将具有举足轻重的作用。

2.1酶的分类与中草药生物转化反应类型

按照1961年国际生物联合会酶学委员会(EnzymeCommissionofInternationalUnionBiotechnology)规定的分类方法,不管酶的结构和性质如何,仅根据酶所催化反应的类型,将酶分为六大类,即氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶或连接酶,对应为六大中草药生物转化反应类型。图1概述了各类酶的特性与中草药生物转化反应类型[1,2,11]。

2.2酶法转化与中药

近年来,药代动力学研究证明,中药成分中的糖苷类化合物在肠道内难以吸收、生物利用度低、肠内滞留时间较长,在人体内难以直接发挥药效作用,绝大多数需经肠道微生物酶分解为次级苷或苷元,方能发挥药效。从糖苷类化合物的结构角度看,含糖基越多,分子极性越高,水溶性就越大,相反水溶性越低,水溶性大的物质不易被小肠绒毛吸收,不易穿过肠壁,也就不易进入血液而发挥药效,只有被肠道内微生物酶水解后才能被吸收而发挥药效。因此,肠道内微生物酶浓度与酶催化活性直接影响着糖苷类化合物的药效。研究表明,个体差异性影响肠道内微生物酶浓度与催化活性[12,13],患者体温的升高会影响酶催化活性的发挥;随着现代医学事业的发展,滥用抗生素已经严重损害人肠道内的正常菌群,使肠道菌群失去平衡,不能分泌各种正常酶[14]。这些因素严重影响着中药药效的发挥。

如何将中药材中的糖苷类化合物转化成次级苷或苷元,将成为中医药现代化研究中的新热点,可通过化学转化、酶转化、微生物转化等方法实现之。化学转化过程中,因强烈的酸碱水解作用而引起苷类物质结构和构型的改变,导致药效消失和产物不稳定。因此,酶转化与微生物转化将更具潜力,微生物转化的本质仍是酶转化,酶转化是中草药生物转化工程中的重要内容。在酶的催化作用下对中药中的苷类成分进行系列结构修饰,引起中药成分的共价结构发生改变,如化学基团的引入或去除、化学键的引入或断裂等。修饰后,可引起药理活性的改变,或中药制剂(尤其是中药口服液)风味的改善等。

有关酶法转化中药的研究开展时间不长,尚处于实验研究阶段。但是,不少学者已逐步认识到生物转化技术将是中药创新研究的重要方法之一。近年来,运用现代生物酶工程技术开展现代中药研究,在酶法转化中药研究领域取得了一些成果。如利用自制复合酶对生晒参95%乙醇提取物、人参茎叶总皂苷、三七总皂苷、三七茎叶总皂苷等系列中药有效部位进行了酶法转化研究[2,15],通过HPLC和LC-MS分析发现可以明显改变一些皂苷成分的结构,并降低相应化合物的极性,增加了有效部位中脂溶性含量;同时,利用这些复合酶直接酶法转化处理人参、三七、三七茎叶等药材,结果表明复合物酶亦能高效地转化药材中部分皂苷成分为低极性皂苷。这些低极性皂苷具有抗癌、免疫调节、改善微循环、调节消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆和学习能力等多种生物活性和药效作用,还具有快速吸收、高生物利用度等特点。用酶法辅助提取清热中药黄芩活性成分时,HPLC分析发现提取物中的黄芩素和汉黄芩素等苷元含量远远高于药典的提取方法,表明酶法辅助提取有助于黄芩苷、汉黄芩苷等转化成相应的苷元[16,17]。

3生物中药的发展方向

上文从微生物工程与中药、酶工程与中药等两方面综述了中草药生物转化工程的核心内容;同时,在中药储存、炮制、方剂配伍煎制、体内代谢等过程中也涉及到生物转化,囿于篇幅,不再详述。

中草药生物转化工程融合了传统中药制药工程、传统发酵中药技术、现代微生物技术、酶工程技术、中药成分的代谢工程等多种工程技术,其在中药新药研究开发方面具有的独特优势,可为改善中药功效、加快中药制剂的起效速度、提高生物利用度、改善制剂功效的个体差异性、创制新剂型、创制新药等方面提供崭新的技术手段,有望给中药新药研究开发注入新的活力,并将为中药创新带来革命性的变革,具有广阔的发展前景,预计不久将成为中药创新研究中的“红热点”。中草药生物转化工程的发展方向将影响生物中药的未来发展前景,今后应在以下几个方面进行深入研究:①中草药储存过程的生物转化及霉变生物转化机制研究;②中草药炮制过程中的生物转化机制研究;③方剂配伍中的生物转化原理及方剂煎制过程的生物转化研究;④加强微生物和酶工程技术在中药研究中的应用;⑤加强曲剂制备过程中的生物转化机制研究;⑥加强粪便类中药的生物转化机制研究;⑦加强生物中药制药装备的研究;⑧利用现代分析技术,建立快速而灵敏的分析检测技术手段;⑨建立有效而快速的功效筛选模型;⑩加强中药成分体内代谢转化及功效个体差异性的研究;(11)在生物转化研究过程中如何合理地贯彻中医药理论及现代科学方法论的指导思想,并吸收利用现代科学的有益成果。

参考文献:

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BiotransformationEngineeringofTCMandtheInnovationofTCM

YuChunhao,ZhangHaijiang,ZhangPing

(HuaiyinInstituteofTechnology,Huaian223003,China)

药品微生物研究篇4

【关键词】细胞培养生物制药应用

随着生命科学理论和技术的飞速发展，细胞培养技术的地位和作用日益成熟，动物细胞培养的研究取得了可观的效果，并且有着无限的应用发展前景。主要的发展目标包括：开发生长密度高、目标产品分泌量大的细胞系；研制性能优良、吸附与解离容易、重复利用的微载体；开展规模化的生物反应器、检测系统、细胞培养与产物分离耦合系统等；设计新型培养基促进生物制品安全；研究三维细胞的培养条件[1]。

生物制药即运用生物化学、医学、微生物学等原理和方法，利用生物机体、组织、细胞、体液等生产具有预防、诊断和治疗功能的药物制品。有关研究者采用基因重组技术或其他创新生物技术生产治疗性药物，主要产品有基因工程药物、抗体工程药物、疫苗等几类。这些产品的开发研制及生产过程都离不开细胞培养技术。

1疫苗生产

疫苗免疫是最有效的预防感染性疾病的措施之一。疫苗免疫是指利用病毒性制剂、细菌性制剂及类毒素等人工主动免疫制剂，通过作用于机体的免疫防御系统起到免疫应答作用。传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但当面临高致病性流感全球大流行、微生物感染、内毒素残余量多等问题时，传统的鸡胚生产方法可能难以满足疫苗市场的需求。随着细胞培养技术的完善及其优点的体现积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗，未来将会越来越多依靠细胞培养技术获得理想的疫苗。与此同时也存在一些缺陷，尤其是哺乳动物细胞培养的病毒疫苗特别适合于工业的发展，应用微载体大规模培养细胞生产流感疫苗，使得流感病毒适应传代细胞（如VERO细胞），该细胞不仅培养条件要求不高而且遗传性状稳定，对多种病毒的感染敏感[2]，如利用生物反应器大规模进行病毒繁殖，可实现流感疫苗的规模化生产。MDCK细胞系是被公认为最适于生产甲、乙型流感病毒疫苗的细胞系，对流感病毒增殖快、感染效率高，且不易变异[3]。其中典型代表，如巴斯德公司利用1000L反应器微载体培养Vero细胞生产人用狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗。由此可见，利用细胞培养疫苗已成为目前疫苗研制的重要应用方向。

2单克隆抗体制备

单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。研究Hb在帕金森病中的发病机制，李旭颖等[4]制备抗Hb单克隆抗体，由重组人Hb作为抗原免疫小鼠，并将其细胞融合及细胞培养制备成杂交瘤，经过筛选获得抗人Hb单克隆抗体杂交瘤株，体内诱生法制备腹水经过酶联免疫吸附试验等方法进而获得特异性抗Hb单克隆抗体。张培等[5]制备乙型脑炎病毒的单克隆抗体通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法，应用ELISA等免疫学方法进行特异性和亚型的鉴定，为快速检测方法的建立奠定了基础。单克隆抗体药物研发已经被列入863计划和国家重点项目，国内已经有2个治疗性单抗产品准备生产，3个治疗性产品处于临床试验阶段，多个抗体药物处于临床研究阶段，已经批准的治疗性单抗有31个，目前国内正在进行临床前研究的抗体药物有：抗CEA嵌合抗体；抗破伤风抗体及抗乙型脑炎等[6]。

3药物筛选

药物筛选是从天然或合成的化合物中筛选出高效的新药或先导化合物。生物活性和药理作用检测所筛选出的高效的新药或先导化合物，并根据检测结果评价某一物质的药用前景，是新药研究的最初过程和关键步骤。体外二维和应用球状聚集体、细胞片层、脱细胞基质进行三维培养肝细胞的具体技术是进行药物毒性检测的重要途径[7]。Kostadinava等建立了一种长时间的三维肝细胞共培养体系，比单层培养肝细胞能更好地检测体内药物导致的毒性。细胞水平的药物筛选更接近人体生理状态，外界环境干扰少，准确率高，是细胞水平药物筛选模型的核心技术高内涵筛选。高内涵药物筛选主要在微阵列多孔板上完成，通过在微孔板上进行细胞培养，施加药物刺激进行实验操作和数据的采集和分析。HCS技术可完成各种对于细胞生理现象本质的研究，Talyor等[8]提出高内涵概念，HCS模型主要建立在细胞水平，通过观察样品对固定或动态细胞的多个功能的作用，涉及各种不同的靶点，从多个角度分析样品的作用，最终确定样品的活性和可能的毒性。近年来发展起来的微流控芯片技术有可能成为细胞水平药物筛选的理想选择。Ye等[9]构建了一套用于细胞水平药物筛选研究的集成化微流控芯片系统，它可以将细胞种植、培养、标记、加药、梯度稀释等操作通过微通道网络流体控制技术集成到一张芯片完成，保持了细胞结构的完整性，可全面记录细胞对药物刺激的各种反应。

药品微生物研究篇5

【摘要】

目的测定磷酸川芎嗪微透析体内回收率并对其稳定性进行考察。方法采用反透析法测定回收率，考察流速、浓度对回收率的影响。结果反透析法测定的体内回收率与媒介中磷酸川芎嗪的浓度无关，稳定性良好。结论微透析取样技术可用于磷酸川芎嗪的药动学研究，体内研究的反透析法可作为微透析研究中磷酸川芎嗪回收率的测定方法。

【关键词】磷酸川芎嗪微透析体内回收率

Abstract:ObjectiveTodeterminetheinvivorecoveryoftetramethylpyrazinephosphate(TMPP)inmicrodialysisprobesandtostudyitsstability．MethodsTherecoveryofTMPPwasdetectedbyretrodialysismethod．Theeffectofflowratesandconcentrationsonrecoverywasstudied．ResultsTMPPrecoverywasindependentofTMPPconcentrationintheexternalmediumbyusingretrodialysismethod．TMPPrecoveryhadgoodstability．ConclusionMicrodialysissamplingcanbeusedforthepharmacokineticstudyofTMPPandretrodialysismethodcanbeusedforthedeterminationofTMPPrecoveryinvivo．

Keywords:Tetramethylpyrazinephosphate(TMPP)；Microdialysis；Invivorecovery

微透析(Microdialysis，MD)技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件(即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中浓度)下，灌注埋在组织中微透析探针，组织中待测化合物沿浓度梯度逆向扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，它是一种动态连续的取样方法［1］。近年来，它在药代动力学研究领域，尤其是在药物分布及代谢研究中有重要应用，发展速度极快。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是中药川芎中的主要活性生物碱，磷酸川芎嗪(Tetramethylpyrazinephosphate，TMPP)为其磷酸盐，临床上广泛用于缺血性脑血管病的治疗。作者拟采用微透析技术研究磷酸川芎嗪在体内的药动学行为，因此有必要测定TMPP体内回收率来评价其体内微透析采样的可行性，本试验采用微透析技术对磷酸川芎嗪在大鼠体内的回收率进行了相关研究，为进一步采用微透析技术探讨磷酸川芎嗪在体内的药动学行为提供实验依据。

1仪器与试药

高效液相色谱仪:DionexSummitP680(DIONEX公司)，微透析设备(SwedenCMA公司)：微透析探针CMA/12MicrodialysisProbe:膜外径0.5mm，活性透析膜长度4mm，分子量截留值为20kD；CMA/20MicrodialysisProbe：膜直径0.5mm，活性透析膜长度为10mm，分子量截留值为20kD;灌注器推进泵(CMA402SyringePump)，灌注器(CMA1.0mlExmireMicrosyringe，MS-GAN100)。磷酸川芎嗪对照品购于中国药品生物制品检定所(批号：100845-200501)。SD大鼠（广州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK粤2006-003）。色谱甲醇(DIMA公司)，水为纯水，其他试剂为分析纯。

2方法

2.1色谱条件色谱柱为PhenomenexLunaC18(4.6mm×250mm，5μm);流动相为甲醇水（3∶2，V/V）;流速为1.0ml·min-1;检测波长：295nm;柱温室温；进样量20μl。

2.2空白林格氏液的配制分别称取氯化钠8.5907g，无水氯化钙0.2553g和氯化钾0.2982g溶解于蒸馏水中，定容至1000ml，用0.22μm的水系微孔滤膜过滤，超声20min脱气，即得林格氏液(Ringer's液)。

2.3标准曲线的制备精密称取五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的TMPP标准品3.93mg置于100ml量瓶中，Ringer's溶液定容，振摇即得浓度为39.3μg·ml-1的标准品贮备液。对标准品贮备液进行倍比稀释得质量浓度分别为0.131，0.393，0.786，1.179，1.572μg·ml-1标准品液，均进样20μl，以标准品浓度(X)对峰面积（Y）进行线性回归，得回归方程Y=0.257X-0.0031，r=0.9998，TMPP在0.131～1.572μg·ml-1范围内呈良好的线性关系，在该色谱条件下的最低检测限为5ng·ml-1。

2.4精密度考察取0.393，0.786和1.179μg·ml-1的3种浓度标准品溶液分别在1d内连续进样5次，进样20μl/次，另分别在连续5d内每天进样1次，进样20μl/次，考察日内精密度和日间精密度，结果表明标准品液的日内精密度RSD分别为0.93%，0.73%和0.68%，日间精密度RSD分别为1.58%，1.25%和1.08%，表明精密度良好。

2.5体内微透析试验

2.5.1TMPP林格氏液的配制分别精密称取TMPP适量，加林格氏液溶解定容，微孔滤膜过滤，得TMPP浓度分别为0.142，0.710，1.42μg·ml-1的林格氏液。

2.5.2探针的植入雄性SD大鼠约300g左右，腹腔注射20%乌拉坦麻醉，体温维持在37℃，在颈部开一个切口，分离右颈静脉，微透析探针CMA/20用导引管植入右颈静脉，固定探针，然后大鼠移到脑部立体定位仪上，平行于矢状缝上做一中线切口，前囟作为定位脑部探针的基点，坐标为AP，+0.2mm，ML，-3.0mm，DV，-7.5mm，用颅钻在相应位置钻一个直径1mm左右的孔，脑部探针CMA/12用立体定位仪支架缓慢植入，两只探针均以空白Ringer's液2μl·min-1灌注2h平衡，之后收集空白样品3份，时间间隔15min，作为阴性干扰试验样品，在本试验所采用的色谱条件下，TMPP峰形良好，无杂峰干扰测定，具有较高的特异性，分析条件可行。相关色谱图见图1。

2.5.3流速对回收率的影响灌流液的流速是影响探针回收率大小的重要因素之一。灌流液的流速越快，其流经半透膜时，膜内外药物的平衡时间就越短，导致回收率越低。在体内微透析试验中，由于探针外部组织液的药物浓度未知，一般可通过反透析法测定药物经过半透膜时的流失量来间接计算探针的体内回收率。

探针植入平衡后，用TMPP浓度为1.42μg·ml-1的Ringer's液在不同流速(1.5，2.0，2.5μl·min-1)下灌注探针。每种流速收集前均平衡1h，共收集5份微透析液样品，每份30μl，HPLC法测定透析液中TMPP浓度(Cdialysis)和灌注前Ringer's液中TMPP浓度(Cperfusate)，按公式RL=(Cperfusate-Cdialysis)/Cperfusate×100％（公式1）计算TMPP的回收率。结果见表1。表1不同流速下磷酸川芎嗪的体内回收率（略）

结果表明，随着流速的增加，TMPP体内回收率呈降低趋势，这为反透析法测定TMPP体内回收率提供了实验依据。

2.5.4浓度对回收率的影响在体内微透析试验中，探针周围细胞外液中的药物浓度是可变的，为了保证透析液中药物浓度的变化能正确反映组织中药物浓度的变化，探针的回收率大小必须相对稳定，即探针的回收率与组织中药物的浓度无关，这是利用微透析技术测定细胞外液中药物真实浓度的理论前提。本实验利用反透析法考察浓度对回收率的影响。探针植入平衡后，用TMPP浓度分别为0.142，0.710，1.42μg·ml-1的Ringer's液以2.5μl·min-1的流速灌注探针。每种浓度收集前均平衡1h，共收集5份微透析液样品，每份30μl，HPLC法测定透析液中TMPP浓度，按公式1计算回收率，结果见表2。表2不同浓度磷酸川芎嗪的体内回收率（略）

结果显示，当以2.5μl·min-1的流速灌注探针时，在3种不同TMPP浓度的透析媒体中，所得回收率很接近，表明在0.142～1.42μg·ml-1浓度范围内，TMPP的回收率与浓度无关。

2.5.5回收率的稳定性考察体内微透析试验持续的时间一般较长，同一根探针常常需要连续取样几个小时，如果在长时间的取样过程中回收率发生较大的变化，那就会失去微透析技术本身的意义。因此，有必要考察TMPP体内回收率的稳定性。

探针植入平衡后，用TMPP浓度为1.42μg·ml-1的Ringer's液以2.5μl·min-1的流速灌注探针，每30min收集1次透析液，灌流6h。测定透析液中TMPP浓度，按公式1计算回收率，结果见图2。

结果表明，当灌流液流速为2.5μl·min-1时，TMPP体内回收率在6h内基本保持稳定，脑微透析探针与血液微透析探针的体内平均回收率分别为17.89％和39.69%，RSD分别为9.16％和8.67%，说明探针的体内回收率具有良好的稳定性。

4讨论

微透析取样技术可以在许多活体组织及细胞外液中在体取样，在药物动力学及药效学研究中具有独特的优势。相对于其他生物取样技术，微透析技术具有以下几个方面的显著特点：①时间分辨性，可连续跟踪体内多种化合物量随时间的变化；②空间分辨性，取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点目标化合物的浓度，同时在体内不同部位插入探针可研究目标化合物的体内分布;③提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物，对药物研究具有重要意义；④样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定。此外，应用MD技术研究药动学勿需采血即可从同一动物收集大量样本而不损失体液量，避免了传统研究方法中因采血后血容量减少所造成对药物分布及消除的影响，其时间分辨性可使药动学资料更准确［1，2］。

在微透析取样方法中，探针回收率是将微透析技术应用于药动学研究的一个关键问题，其大小受探针的性质(如有效膜的长度、膜孔大小等)、待测物的性质(脂溶性、蛋白结合率、分子大小等)、灌流液的组成(亲脂性、pH值等)、流速等诸多因素的影响［3］。探针回收率的测定主要有零净流量法、反向透析法、外推至零流速法等［1］，应用反向透析法校正微透析探针回收率的原理是探针的回收率和释放率相等，在两者相等的条件下，用药物自身的释放率校正相对回收率可以减少实验误差，是一种准确的校正方法。但是探针对药物的相对回收率和释放率是否相等取决于药物本身的性质，并非所有药物都可以应用，作者所在课题组已经对TMPP的体外回收率进行了相关研究［4］，结果证明探针对TMPP的体外回收率和释放率相等，因此，体内试验测定的微透析探针对TMPP的释放率即为探针的体内回收率。

由于TMPP在体内的半衰期较短，在回收率满足要求的前提下、应尽可能的提高时间分辨性，故本研究在体内试验中最终选择2.5μl·min-1的流速，本文的研究结果为微透析技术用于TMPP的体内药动学研究提供了实验依据和方法支持。

参考文献

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药品微生物研究篇6

[关键词]微波干燥灭菌；中药制剂；中药炮制

[中图分类号]R283[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2015）05（c）-0050-04

[Abstract]ThispaperreviewstheresearchprogressofmicrowavedryingsterilizingintheproductionfieldoftraditionalChinesemedicinepreparationandprocessing.Microwavedryingsterilizationhastheoutstandingadvantagesofhighenergyutilizationeffect，fastdryingspeed，uniformdryingeffect，sterilizationability，automationcontrolandsoon，soitdeservestobewidelyusedinthefieldoftraditionalChinesemedicineproduction.

[Keywords]Microwavedryingsterilization；Chinesedrugspharmaceutics；Chinesemedicinalherbspreparation

微波是指波长极短（0.001～1.000m）、频率范围在3.0×102～3.0×105MHz的电磁波。它具有很强的穿透能力，并且能产生显著的反射和直线传播，在振荡周期极短的微波高频电场内与物质相互作用会产生特定效应[1]，作为一种新能源，在国防、科研、生产、药品食品等卫生领域中已被广泛应用，并表现出较大的优越性。

微波干燥技术起源于20世纪40年代，最初主要用于食品、化工等行业，随着对微波技术的深入研究和微波工业设备的发展，到20世纪60年代末微波已能应用于加热、干燥、杀虫、医疗等工业项目。将微波技术与其他科学技术相互渗透，彼此结合又不断产生新的应用领域是微波技术发展的一大特点。近年来又将微波的干燥和灭菌等技术引入到中药的生产中并广泛应用正是这种技术应用领域的又一扩展。本文就近几年微波干燥灭菌技术在中药生产领域中的应用做一个概述，以进一步推广应用，扩大其应用范围，发挥其更大的优势。

1微波干燥与微波灭菌

1.1微波干燥

微波干燥不同于热风、蒸汽、电加热等外部加热方法，而是材料在电磁场中由介质损耗引起的一种内部加热方法，即在微波干燥过程中，高频电场以每秒几亿级的速度周期性改变外加电场的方向，物料中的极性分子迅速随高频交变电场方向交互变化而做高频振动，分子间摩擦挤压、碰撞使一部分微波能量转化为分子运动能，并以热量的形式表现出来，物料内部和表面温度同时迅速升高，从而达到干燥的效果[1]。微波干燥系指由微波能转变为热能使湿物料干燥的方法。

传统的干燥是由于内外部的温度差进行热传导，内部温度低于外部，干燥效果比外部差，干燥慢且不均匀。微波干燥中物料内外的水分子一同气化，其热传导方向与水分扩散方向相同，具有内外部温度梯度负效应小、干燥速度快、干燥效果均匀、节能、与其他干燥法相容性好、易实现自动化控制和提高产品质量等优点[2]，但是一次性投资和运行费用比普通干燥方法高，已应用于轻工业、化学工业及农产品加工、食品加工、中药材、动植物标本等方面。

1.2微波灭菌

微波灭菌是电磁场的热力效应和生物效应的双重杀菌功能。一方面，细菌和蛋白质在高频交变电场中受热，出现细胞核浓缩、溶解，细胞缩小、解体，蛋白质受热凝固死亡，从而达到杀菌的目的；另一方面，在微波交变电磁场中，细菌出现电性质的强烈反应，细胞膜断面的电位分布、细胞膜周围的电子、离子浓度发生变化，电容性结构的细胞膜被击穿破裂。同时，细菌赖以生存的离子通道出现调节功能障碍，细菌结构功能紊乱，生长发育受到抑制，从而造成细菌死亡，此即为微波灭菌的生物效应[3]。

微波灭菌优于传统的烘箱灭菌，微波用于中药及其制剂的灭菌，均可在较低温度和较短时间内完成，灭菌效果安全可靠，能源利用率高，适用性广，生产成本低。在生产中，干燥和灭菌可同时进行易实现自动化操作，与热力灭菌相比，不需要热传导过程，受热均匀，灭菌后无有毒有害残留物产生和存在，易满足环保要求[4]。

2微波干燥在中药生产方面的应用

2.1微波干燥技术在中药制剂中的应用

2.1.1微波干燥技术在中药丸剂、散剂和胶囊剂中的应用汤宗武[5]采用稳定的工艺参数连续生产水蜜丸及水丸各10批，结果发现微波干燥后水蜜丸及水丸水分、外观、溶散时限、微生物限度、含量测定均符合规定且耗时短、效果好。梁毅等[4]分别用微波和传统方法干燥了白一丸，结果表明微波干燥较传统的方法干燥时间短，温度低，成品外观色泽好，丸药的收缩率小，且灭菌效果优于烘箱干燥。余科夫[6]用微波干燥法干燥水丸、水蜜丸、浓缩水蜜丸，其成品丸剂的水分、外观、溶散时限、微生物限度、含量等各项指标均达到国家标准，并且经多方实践证实，微波干燥中药丸剂干燥速度快、效果好、灭菌性能优越，而且能源利用率高，值得在中药丸剂的生产中广泛推广。徐晓彬等[7]采用正交实验法优选微波技术干燥胃舒散的最佳工艺条件，结果表明经优选的工艺干燥时间短、效果好，微波法干燥试样比传统烘箱法迅速，且效率高、效果好，试验符合要求。如果用微波法代替传统的方法可大大提高工作效率，节省能源。王珂等[8]用微波干燥和真空厢式干燥两种方法干燥香菊胶囊，并对其与质量相关的各项指标进行测定，结果所得到的实验数据均达到内部质量标准的要求。且微波干燥技术具有干燥温度低、速度快、有效成分损失少等优点，说明微波干燥可用于香菊胶囊的生产过程中。微波干燥丸剂、散剂和胶囊剂时，具有灭菌效果好、干燥速度快等优点。但物料内部的水分和温度会随着干燥时间的延长而发生变化，此时需要通过调整微波功率或者间歇式微波能量输入的办法来控制物料温度和产品的水分。因此根据处理对象成分的特点，选用合适的微波干燥工艺条件对最终产品的质量具有重要影响。

2.1.2微波干燥技术在中药浸膏中的应用浸膏干燥通常采用热风烘箱、有的采用减压干燥、喷雾干燥、真空干燥等。普通干燥方法一般干燥时间长，温度较高，生产效率低，浸膏表面容易结壳，干燥过程很难控制，因而会影响干燥产品质量。微波真空干燥浸膏加热均匀，干燥速度快，效率高，成品质量好，并且还具有灭菌的效果，已逐渐在中药浸膏生产中推广应用。刘顺航等[9]采用微波技术对柴胡浸膏、黄芪浸膏、白芍浸膏等中药浸膏的干燥失重进行测定，分别考察微波功率、干燥时间及试样数量对干燥失重率的影响。结果表明，与烘箱法比较，微波干燥节省了能源，提高了工作效率，能够适用于中药浸膏干燥失重的常规分析。王莹等[10]分析了不同微波功率、载样量对失水速率及物料温度的影响规律。在此基础上，将试验数据与常用的薄层干燥模型进行拟合检验，成功建立了赤芍浸膏微波真空干燥的水分比与干燥时间之间的动力学模型。运用此模型能够较准确地预测微波干燥过程中赤芍浸膏含水率的变化，为微波真空干燥过程的优化和控制提供了理论依据。同时王莹等[10]也选用L9（34）正交试验法和多指标综合评分法对工艺参数进行优化，确定地黄叶浸膏微波真空低温干燥的最佳工艺条件，并与真空烘箱干燥、真空带式干燥和冷冻干燥等方法进行比较研究。结果表明与其他干燥方法相比，微波真空干燥具有干燥产品含水率低、有效成分损失少、干燥时间短且操作简便等优点，工艺稳定可靠，有较大的工业化应用价值。

2.2微波干燥在中药炮制中的应用

微波干燥中药及炮制品，在高频交流电场中，极性分子随着高频电场周期性的改变而发生旋转运动，分子间互相磨擦、碰撞产生大量的热量，物料借助水分汽化产生的压力冲破细胞壁和细胞膜，形成微小的孔洞或裂缝，使物料质地酥脆而达到炮制的目的[11]，具有速度快、时间短、加热均匀、产品质量好、热效率高等优点。微波炮制技术正在逐步应用于中药炮制中，主要用于炒法、炙法、煅法等。

2.2.1微波干燥技术在炒法中的应用杨晓东等[12]采用微波加热炮制王不留行和芥子，并与药典传统的清炒法比较，结果表明微波炮制品的外观及薄层色谱鉴别均符合药典的要求，且浸出物的含量和有效成分的含量均高于传统的清炒法，说明微波炮制优于传统的清炒法，值得深入研究和大力推广。王晨晖等[13]采用正交实验设计优选微波炮制芥子的最佳工艺并与传统的炒黄法及生品比较，结果显示微波炮制和传统的炒法均能降低水分的含量，提高有效成分的含量，尤以微波炮制品效果最佳，且微波炮制品“杀酶保苷”的效果好，亦能使芥子质地酥脆便于粉粹和贮存。微波炮制芥子优于传统的炒法且工艺可控。朱卫星[14]以“鼓起，卷曲，呈金黄色或棕黄色，质酥脆”为炮制品的性状标准，探讨微波炮制穿山甲的最佳工艺条件，经优选后，微波法显著优于传统砂烫法，其炮制品水溶性浸出物、蛋白质含量和成品率均较高，且方法简便、安全、效率高、无污染，可为工业化生产提供理论依据。

2.2.2微波干燥技术在炙法中的应用陈方等[15]以外观形状，炙甘草的水分、总灰分、酸不溶性灰分以及甘草酸的含量为指标，考察微波干燥法对蜜炙甘草的影响，并与传统的炙法比较，结果显示微波炮制品不仅外观形状优于传统的蜜炙法，且甘草酸含量也高于传统的蜜炙法，水分差异较显著，总灰分、酸不溶性灰分均符合《中国药典》的要求，微波干燥值得在中药炮制中推广。李爱光等[16]以甘草酸含量、性状为指标，采用正交试验法优选微波干燥法蜜炙甘草的炮制工艺，结果优选后的微波干燥法蜜炙甘草的炮制工艺操作简便、合理可行。许志等[17]采用L9（34）正交试验法以成品外观质量和芍药苷的含量为指标，优选微波酒制白芍最佳工艺，并与传统法和烘干法比较，结果表明微波炮制成品外观质量优于传统法和烘干法，且节约能源。

2.2.3微波干燥在煅法中的应用张义生等[18]采用微波干燥法炮制白矾，其炮制品不仅水中溶解性好，溶液澄清透明，而且较其他炮制方法具有速度快、操作简便、安全的特点。邹节明等[19]通过正交实验优化微波炮制硼砂的条件，以水分为指标对煅硼砂的储存条件进行研究。结果表明微波法可将30g硼砂在30min内煅制完毕，400℃恒温烘干法可准确反映煅硼砂中的水分，微波法是一种较理想的实验室炮制硼砂的方法，简便快捷。

2.2.4微波干燥技术在蒸、煮、矸ㄖ械挠τ包国林等[20]在苦杏仁炮制方法探究中表明，采用微波炮制时杀酶保苷的效果明显优于传统的清炒法和矸ㄇ矣檬倍蹋苦杏仁苷的含量也较高，符合中国药典的规定。微波炮制法为加工炮制中药材提供了新技术，值得进一步研究。杨明等[21]比较生附子、白附片、香港炮附子、微波炮附子的毒性和药效，为临床选用附子提供科学依据。结果表明采用微波炮制后，不仅保持了原有药效，且杀酶保苷和降低毒性的作用均优于传统的蒸煮矸ǎ还具有促进幼鼠腺体生长发育、抗心机缺血等作用。尉芹等[22]采用微波法、蒸法等不同的炮制法对中药材杜仲进行炮制，考察其对杜仲叶品质的影响。结果表明，与其他方法相比，微波处理时间段，较好地保存了杜仲叶的绿色，并除去了叶子的草青味，并且保持了各种成分的含量，因此微波处理是一种较佳的炮制方法。微波干燥技术的利用为中药炮制提供了新方法和新手段，与传统炮制法比较，其操作更加简便，微波炮制法的温度、火候、时间易于掌握，易实现炮制工艺自动化，能较好地保留原药材的色、香、味，成品色泽美观，饮片洁净度高，无环境污染，工艺指标可量化；还提高了中药饮片的质量和临床疗效。因此，微波炮制是中药饮片炮制较为理想的方法之一，值得在小包装中药饮片中推广应用。

3微波灭菌在中药生产方面的应用

3.1微波灭菌技术在中药丸剂、散剂中的应用

微波灭菌技术用于中药制剂，干燥速度快，能源利用率高，灭菌效果好，而且可以进行连续化、自动化生产，效率高、生产环境好，符合GMP要求，同时大大降低制剂生产成本[4]。朱新科等[23]采用微波法和流通蒸汽两种方法对六味地黄丸进行灭菌，计算不同工艺灭菌前后丹皮酚损耗率，结果表明微波灭菌丹皮酚的损耗率小于流通蒸汽灭菌，主要原因是微波灭菌时间短、温度低，微波灭菌工艺优于流通蒸汽灭菌工艺。夏晨等[24]采用微波技术对消石利胆丸和妇宁丸进行干燥灭菌，与普通的烘房干燥灭菌相比较，微波干燥灭菌效果显著且可以达到现代中药制剂的质量标准，又比传统的烘房干燥节省时间。物料的类型不同则微波灭菌效果也不同。对于含动物、油脂类成分的丸剂品种，微波对其溶散时限有较大影响。对于含水量高的物料，含水量越高，吸收微波能就越多，灭菌效果也越好[25]。

3.2微波灭菌技术在口服液类药品生产中的应用

口服液中通常含有糖、生物制剂和丰富的营养物质等，很容易被污染，在储存过程中细菌易繁殖，除了添加防腐剂外，采用微波灭菌的方法也能有效解决上述问题。余涛等[26]采用微波技术对大黄附子口服液进行灭菌，并与高压灭菌和煮沸灭菌比较，微波灭菌后溶液的颜色、澄明度、有效成分含量均与未灭菌时一致，而高压灭菌和煮沸灭菌后药液的颜色加深，澄明度降低，且有效成分的含量有不同程度的损失；药效学方面均优于或相当于煮沸灭菌和高压灭菌，且省时省力，说明微波灭菌可用于口服液制备中的灭菌。康志英等[27]采用隧道式微波灭菌设备对抗病毒口服液、清肝利胆口服液、肌苷口服溶液进行微波灭菌，对该工艺和新设备进行了验证，结果表明该工艺对各口服液产品均有良好的灭菌效果及重现性，微波干燥灭菌可用于口服液大生产应用中。

3.3微波灭菌在中药炮制中的应用

张咏梅等[28]考察了在相同的微波温度及含水量下，不同微波灭菌时间对黄芩微生物限度的影响，结果显示在一定范围内，微波灭菌的时间越长，黄芩饮片中所含的细菌、霉菌、酵母菌逐渐减少，且微波灭菌时间、温度以及饮片的含水量对黄芩微生物限度有影响。张振凌等[29]按药典中微生物限度检查项下方法测定茜草不同炮制饮片的微生物含量，结果发现微波灭菌后，茜草饮片霉菌和细菌数量显著降低，建立茜草、茜草炭饮片微生物限度具有可行性。

4小结

目前中药生产中，原料及成品的干燥、灭菌通常依靠烘房来解决，由于蒸汽压力的不稳定，热能穿透速度慢，因此干燥时间及干燥程度很难控制，不利于实现自动化生产。再就是烘房的干燥灭菌效果差，在中药生产中也会带来严重的细菌污染问题。随着微波技术的深入研究和微波工业设备的发展，微波干燥、灭菌已广泛应用于中药制剂、中药炮制等生产领域中，展现出了比较明显的优势。

微波干燥灭菌技术具有能量利用率高、干燥时间短且均匀、灭菌能力强、自动化控制程度高等特点，在中药生产中应用前景十分广阔，值得推广。近几年，小包装中药饮片作为国家中医药管理局推广使用的项目，成为中药饮片生产企业的主要产品之一，由于其包装材料的不透气性，某些饮片因水分难以挥发更容易导致霉变等质量问题。因此，对饮片的质量有更加严格的要求。一些中药饮片生产企业将微波干燥灭菌技术应用于小包装中药饮片的生产中，但是对不同质地中药材所选波长、辐照时间、传送带的速度等，尚无供规范操作的技术参数，对微波处理前后中药材的理化性质与卫生状况等也还缺乏比照性研究，也未见其相关的研究报道，值得进一步探讨。

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