细胞遗传学检验篇1

患者27岁，13岁月经初潮（4天/28-30天），经量正常，无痛经，末次月经2014年09月18日。系宫内孕18+2周G4P2双胎，孕4产2，人工流产1次，无难产及大出血病史，孕期查B超：中期妊娠，双胎。夫妻商议后坚决要求终止妊娠入院。入院后给予利凡诺尔100mg羊膜腔内注射引产，约63小时后自娩两个男性死胎，检查：大小与妊娠月份相符，查一胎外观无畸形，一胎见脐部有一2.0*3.0cm腹壁缺损，部分肠管外露。查胎盘一个，双羊膜囊。追问病史：患者孕期无上呼吸道感染，未接触毒物及放射性，未服其他药物，其爱人有吸烟、喝酒嗜好，家族无此类遗传病史。

讨论：双胎妊娠：（1）双卵双胎，两个卵子分别受精形成的双胎妊娠，两个卵子分别受精形成两个受精卵，各自的遗传基因不完全相同。故形成的两个胎儿有区别，如血型、性别不同或相同，但指纹、外貌、精神类型等多种表型不同，胎盘多为两个，也可融合呈一个，但血液循环各自独立。（2）单卵双胎，有一个受精卵分裂形成的双胎妊娠。形成原因不明，不受种族、遗传、年龄、胎次、医源的影响。一个受精卵分裂形成两个胎儿，具有相同的遗传基因，故两个胎儿性别相同，血型及外貌等相同。

肠外翻是胎儿先天畸形的一种，发生的原因很多，主要为遗传、环境、食品、药物、病毒感染、母儿血型不合等。一旦发现双胎妊娠或多胎妊娠，应行产前筛查及产前诊断，诊断胎儿畸形，应及时处理及治疗。

产前筛查试验不是确诊试验，筛查结果阳性患者需进一步做产前诊断。目前广泛应用产前筛查的疾病有唐氏综合症和神经管畸形的筛查。唐氏综合症的筛查方式很多，根据检查方法分为孕妇血清学和超声检查，根据筛查时间分为孕早期筛查和孕中期筛查。妊娠中期血清学筛查通常采用三联法，即甲胎蛋白（AFP）、绒毛膜促性腺激素（hCG）和游离雌三醇（uE3），唐氏综合症患儿AFP降低。hCG升高，uE降低，根据三者的变化，结合孕妇年龄、孕龄等情况，计算出唐氏综合症风险度。妊娠早期筛查方法包括孕妇血清学检查、超声检查，或两者结合。

产前诊断：又称宫内诊断，或或出生前诊断，是指在胎儿出生之前应用各种先进的检测手段，如影像学、生物化学。细胞遗传学及分子生物血等技术，了解胎儿在宫内发育状况。产前诊断对象：35岁以上高龄孕妇；生育过染色体异常的孕妇；夫妇一方有染色体平衡易位；生育过无脑儿、脑积水、脊柱裂、唇腭裂、先天性心脏病儿者、其子代再发生儿率增加；性连锁隐性遗传病基因携带者，男性胎儿有1/2发病，女儿有1/2携带者，应作胎儿性别预测；在妊娠早期接触过化学毒物、放射性物质，或严重病毒感染的孕妇；有遗传性家族史或近亲婚配史的孕妇；原因不明的流产、死产、畸胎或有新生儿死亡史的孕妇。；本次妊娠有羊水过多、羊水过少、发育受限等，疑有畸胎的孕妇。产前诊断的方法有：（1）观察胎儿结构利用超声、X线检查、胎儿镜、磁共振成像等，观察胎儿结构有无畸形。（2）染色体核型分析利用羊水、绒毛、胎儿细胞培养，检测胎儿染色体疾病。（3）基因检测利用DNA分子杂交、限制性内切酶、聚合酶链反应技术、原为荧光杂交等技术，检测胎儿基因的核苷酸序列，诊断胎儿基因疾病。（4）检查基因产物利用羊水、羊水细胞、绒毛细胞或血液，进行蛋白质、酶和代谢物检测，诊断胎儿神经管缺陷、先天性代谢疾病等。产前诊断的疾病有：（1）染色体病，（2）性连锁遗传病，（3）遗传性代谢缺陷病，（4）先天畸形。染色体病的产前诊断：主要依靠细胞遗传血方法，因此必须获得胎儿细胞和胎儿染色体，主要有羊水穿刺、绒毛穿刺、脐带穿刺、胎儿组织活检、胚胎植入前诊断、母血胎儿细胞和游离DNA提取。先天性畸形的产前诊断：妊娠期胎儿超声检查可发现许多严重结构畸形以及各种细微变化，逐渐成为产前诊断重要的手段之一。

因此，产前诊断的目的不仅限于出生前发现异常以便终止妊娠，而且使得医生能够在出生前或出生后，把握适当的时机对经过产前诊断的胎儿或新生儿进行药物或手术治疗。且使父母能够了解本次妊娠状况，进而知情选择，达到优生优育的目的。

细胞遗传学检验篇2

【关键词】肝癌;细胞株;核型;比较基因组杂交

Abstract:【Objective】Toestablishhepatocellularcarcinoma(HCC)celllinesandprovidemorepurelivercarcinomacellsforHCCstudies.【Methods】ThecarcinomatissueswereobtainedfromtheprimarylesionandmetastaticlesioninportalveinofHCC.ThecarcinomacellswereisolatedbyPercolldensitygradientcentrifugeandcultivated.Thecellcloneswerethenobtainedbymicro-environmentaldigestionandcelllineswereestablished.Thegrowthcurves,Gbandchromosomekaryotype,comparativegenomichybridization(CGH)oftheestablishedcellswerecharacterized.Thecellswereimplantedinnudemicefortumorigenesis.【Results】20casesofHCCcellswereisolatedandcultivated.Twocelllines(designatedasH2MandH4M)weresuccessfullyestablishedfrom2casesofemboliofportalvein.Thekaryotypeshowedthatbothcelllinesareahypertriploid(71~78chromosomes).Amarkerchromosomecontaining1qand6p[t(1;6)]wasfoundinH2Mcellsandahugemarkerchromosomecontainingalonghomogeneouslystainingregion(hsr)inH4Mcells.ThemaingeneticalterationsanalyzedbyCGHwereahighcopynumberamplificationof1q,3q,5p,6p,7qand8qandlossof4q,13q,16q,17p19pinH2Mcells,whereas,amplificationof6p,7p,11p,11q13andlossof8p,9,13q,16qinH4Mcells.ImplantationofH2Mcellsinnudemiceforamonthproducestypicalhumanhepatocellularcarcinoma,butnotumorforH4Mcells.【Conclusions】Percolldensitygradientcentrifugeandmicro-environmentaldigestionisaneffectivemethodforcloningofprimarycarcinomacellandcelllineestablishment.TwoestablishedHCCcelllineswillprovideculturecellsforHCCstudies.ThegeneticalterationsdetectedinbothcelllinesalsoprovidecluesandcellmodelsforfurtherscreeningofoncogenesandtumorsuppressorgenesinHCC.

Keywords:hepatocellularcarcinoma;HCCcelllines;karyotype;comparativegenomichybridization

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是常见癌症之一。尽管已有多个肝癌细胞系供实验室研究用,但这些细胞多由国外研究人员建立,而且极少从门脉转移灶建立[1]。此外,已建立的细胞系缺乏细胞遗传学改变的资料,不能为肝癌癌基因、抑癌基因的筛选及肝癌转移机制研究提供线索。本文描述2例门脉转移性肝癌细胞系的建立过程并检测其分子遗传学改变,旨在为HCC的深入研究提供实验工具。

1材料和方法

1.1标本来源

20例肝癌组织取自中山大学附属第一医院肝胆外科手术标本,每份癌组织均取原发灶和门脉癌栓,经病理检查证实和进行细胞培养。

1.2细胞培养

原发瘤及门脉癌栓组织用含5倍浓双抗(500u/mL青霉素和500?滋g/mL链霉素)PBS冲洗后剪成约1mm3大小,用0.1%的胶原酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)在37℃下消化30min,用120目不锈钢网过滤。将细胞悬液铺入装有等渗梯度密度PercollTM(AmershamPharmaciaBiotechAB,Uppsala,Sweden)的50mL塑料离心管的上层,Percoll浓度梯度从底层至最高层依次为70%、50%、40%,每层5mL。4℃下3500×g离心30min,离心后在40%层内吸取含细胞的Percoll液,用F12培养液稀释5倍,275×g离心10min。沉淀细胞洗涤3次。最后用含20%胎牛血清、10ng/mL表皮生长因子(EGF)、10?滋g/L转铁蛋白、10mmol/L谷氨酰胺、100mg/L丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100?滋g/mL链霉素的F12培养液悬浮。将5mL含1×106细胞的培养液接种在25cm2塑料培养瓶(Corning

,USA),置37℃、饱和湿度的5%CO2孵箱培养。

1.3癌细胞克隆

培养数天后,通过微环境消化法获取癌细胞克隆。具体方法如下:先将细胞稀释传代,待细胞生长2~3d,然后在倒置显微镜下对单个分散存在的癌细胞克隆位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸去,加入2mL的0.25%胰酶与0.02íTA的消化液预消化。用一弯头管口平整的玻璃吸管吸取约10?滋L的消化液,让消化液保持在吸管口处,将吸管口置于所标记的细胞克隆上面,吹出微量的培养液,随即将培养液重新吸回吸管。将含细胞的消化液置入24孔培养板内,加入约1mL的培养液继续培养。待细胞增多时再进行扩大培养。

采用这种方法,成功培养2例男性肝癌患者的肝癌细胞系,2例均取自门脉癌栓,分别命名为H2M和H4M。

1.4生长曲线

将培养第12代的H4M细胞5.4×104接种在直径5cm的塑料平皿,于接种后第2天开始将细胞消化计数,每天消化3个平皿的细胞数并计算平均值,连续7d,最后绘制细胞生长曲线和倍增时间。H2M采用第16代细胞,接种密度为7×104每平皿,计算方法同上。

1.5细胞核型分析

于培养的H2M和H4M细胞中加入0.3?滋g/ml的秋水仙素,继续培养3h,胰酶消化收获细胞,经0.07mmol/L氯化钾低渗处理30min,于1:3冰醋酸甲醇液固定2h后滴片,所获的中期分裂相染色体用标准胰酶-基姆萨(G带)分带染色法染色。

1.6比较基因组杂交

用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化培养的H2M和H4M细胞,抽提肿瘤细胞基因组DNA。取健康人周围血淋巴细胞制备基因组DNA作正常参照。从健康男性淋巴细胞培养中获取中期分裂相染色体。比较基因组杂交(CGH)采用以前所描述的方法[2]。用缺口平移法分别将1?滋gH4M基因组DNA和性别相同的正常参照基因组DNA标记绿色-dUTP和红色-dUTP。将500ng标记的癌细胞DNA和正常DNA探针变性后与正常中期相染色体在37℃湿盒中杂交48h。用0.4×SSC/0.3%NP-40在75℃洗涤玻片2min、室温下用2×SSC/0.1%NP-40洗涤2min,然后用1?滋g/mLDAPI复染和用抗褪色溶液封片。

1.7图像分析

经CGH杂交后的染色体用ZeissAxiophot显微镜分析,每个中期分裂相用轮转式单色激发碱性蕊香红(rhodamine)、FITC和DAPI,并通过滤镜捕获这三种颜色的图像。用CGH程序(Vysis,DownersGrove,IL)分别分析三色合成图像。每组样本共分析5个中期分裂相,从10条相同染色体所得的荧光数据计算平均比率。根据程序指引分析红色和绿色的荧光比率,DNA序列拷贝数的增加和丢失(gainandloss)分别以肿瘤细胞DNA(绿色荧光)与参照DNA(红色荧光)的比率>1.25或<0.75来界定,当比率>1.50时定为高拷贝数扩增(amplification)。

1.8裸鼠接种成瘤实验

将培养的H2M和H4M细胞各注射于12只balb/c裸小鼠腹腔和肝脏内,每只9×106细胞。接种后观察1个月,看是否成瘤。

2结果

2.1细胞培养

从20例肝癌患者的原发灶和门脉癌栓中获取癌组织进行体外培养,只有2例(H2M和H4M)克隆培养成功。H2M和H4M肝癌细胞在第4代开始加速生长,已传至50多代,部分细胞液氮保存已逾2年。形态学上,两系癌细胞均呈多角形,胞浆丰富,核大,圆形,核仁多个而明显,可见核分裂和瘤巨细胞。癌细胞排列成索状生长,与肝小叶排列相似(图1)。从细胞生长曲线可以看出,H2M和H4M细胞在第2天开始呈对数生长,到第5天进入生长平台期。细胞的倍增时间分别为47h和38h。

2.2细胞遗传学

染色体G带显示2株细胞均为超3倍体,其中H2M有一条标记染色体含有1q和6p[t(1;6)染色体],而H4M有一条染色体含有一长均染区(homogeneouslystainingregion,hsr,图2)。H4M细胞核型为71~78,XX;而H2M细胞为56~78,XY。

2.3比较基因组杂交

CGH分析显示,H2M的细胞遗传学改变为4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增。H4M的细胞遗传学改变为8p,9,13q,16q缺失和6p,7p,11p扩增,而11q13为高拷贝数扩增(amplification)。

2.4裸鼠接种成瘤实验

H2M细胞接种balb/c裸小鼠后4周,腹腔内及肝脏边缘见多发性肿瘤形成,肿瘤直径2~10mm。石蜡切片HE染色显示肿瘤为典型的肝细胞癌(图3)。H4M细胞接种后未见肿瘤形成。

3讨论

本实验采用胶原酶消化肿瘤组织,用Percoll浓度梯度分离得到较纯的癌细胞,但仍不能完全把癌细胞与成纤维细胞或血窦内皮细胞分开。因此在随后癌细胞的纯化培养中,我们采用微环境消化克隆法来纯化癌细胞。尽管已有多种方法进行癌细胞克隆[3],但我们的实践证明,微环境消化克隆法特别适用于原代癌细胞的纯化,该方法可一次取得较多的癌细胞,成功率较高。该方法可重复进行,直至取得纯化的细胞株。本实验培养成功2个肝癌细胞系,为进一步进行实验研究提供了纯化的肝癌细胞材料。

此外,我们采用染色体分带和CGH法初步分析了所获得的肝癌细胞系的细胞遗传学特征,发现H2M的细胞遗传学改变主要为1q和8q扩增,而4q丢失。H4M则主要表现为8p丢失和11q13高拷贝数扩增等各种染色体畸变。这些细胞遗传学改变与肝细胞癌的发生发展、转移和有效治疗方法的选择有密切关系[4,5],Cheng等[6]人根据肝脏门脉解剖特点和肝细胞癌癌栓发展范围将静脉内癌栓分成4种类型,发现不同癌栓类型的患者术后的预后有很大的差别。由于这H2M和H4M均从门静脉癌栓建立(门静脉癌栓虽不等于肝细胞癌肝外转移,但被认为是肝内转移[7,8]),故我们成功建立的这两株细胞可为肝癌转移的研究提供非常有用的工具。

特别值得注意的是H4M细胞系中发现有11q13的高度扩增,这一部位正是周期素cyclinD1基因CCND1所在位点,CyclinD已被认为是肝细胞癌治疗靶点[9],该基因的高表达能促进细胞增殖,减少细胞凋亡。我们的实验已经证明了H4M的cyclinD1mRNA和蛋白的过表达[10]。

目前从肝癌组织中建立细胞系,特别是建立转移性癌细胞系仍很困难,本实验所获得的2例细胞株其中的1例能在裸鼠接种后成瘤,加上对这2株细胞的遗传学改变检测结果,为阐明肝癌浸润转移机制、寻找新的癌基因和抑癌基因,以及抗肝癌药物筛选等实验研究提供了实验癌细胞材料。

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细胞遗传学检验篇3

[关键词]胎儿有核红细胞；产前诊断；孕周

[中图分类号]R714[文献标识码]C[文章编号]1673-7210（2008）06（c）-195-02

目前，对遗传性疾病的产前诊断，根据诊断方法是否对胎儿构成不良影响的程度分为无创性的和有创性的。有创性的产前诊断方法包括绒毛活检、羊膜腔穿刺、胎儿宫内取血等，这些手段虽然诊断准确率较高，但对胎儿有一定的危害，且有导致孕妇发生流产的可能。而从孕妇外周血中富集、纯化胎儿细胞或游离DNA，用于产前诊断则属无创性的。通过胎盘循环进入母体血液的胎儿细胞有许多不同种类，它们是：有核红细胞[1]、滋养层细胞、淋巴细胞和粒细胞。研究发现胎儿有核红细胞因为其拥有完整的胎儿基因组、寿命短而不受上次妊娠影响、形态上易于辨认及多种特异的标记可供选择等特点，成为最佳候选[2]。本研究应用Kleihauer染色法标记胎儿有核红细胞，以初步揭示孕妇外周血中胎儿有核红细胞数目与孕周关系。

1实验材料与方法

标本来源，随机选择2006年9月-2007年3月在沈阳市妇婴医院遗传咨询门诊的30例受试者，妊娠7-26周，取孕妇静脉10ml，枸橼酸钠抗凝。1例男性胎儿脐血作为阳性对照和3例正常未孕女性及3例正常男性做为阴性对照。（均来自于沈阳市妇婴医院节育门诊）。上述样本的采集均获得孕妇及其家属的知情同意，用于无创性产前基因诊断的研究。

1.1不连续密度梯度离心法初步富集有核红细胞

取孕妇静脉血10ml，枸橼酸钠抗凝，经二倍体积PBS（PH7.4）稀释后，轻轻加入到1.085g/ml和1.075g/ml的Percoll液上，400g室温离心30分钟，吸取1.075g/ml和1.085g/ml分离介质之间的细胞层，二倍体积PBS洗3次，每次1200转/分室温离心10分钟。去上清，将离心沉淀部分放入1.5毫升Eppendorf管中，按40个细胞/视野将离心沉淀加入到细胞涂片离心机中，800转/分钟室温离心3分钟制成玻片。

1.2Kleihauer染色法标记胎儿有核红细胞

载有待检细胞的涂片自然干燥后，浸入80%乙醇中固定5min，再浸入预热的柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH3.3~5.0）37℃5min。自然干燥后滴加Mayer's苏木素溶液染色3min，最后用0.1%伊红水溶液复染玻片4min。用流水缓慢冲洗，自然干燥后镜下观测、计数。

2实验结果

Kleihauer法染色标记胎儿细胞阳性胎儿有核红细胞的胞浆呈深红色，而周围母体的有核红细胞则无色。

Kleihauer法能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，最适孕周为孕13~17周。30例孕妇中，有25例检出有Kleihauer染色阳性细胞，其余5例未检出。检出数量从2.2/10ml~14.25个/10ml不等，平均为7.12个/10ml。另外3例正常未孕女性及3例正常男性的外周血中均未检出有NRBC。

3讨论

世界上现已发现的遗传性疾病共有6000多种，并以每年新发现100种的速度递增。以现行的医疗水平，绝大多数遗传病仍缺乏行之有效的治疗手段。产前诊断的目的是出生前判断出胎儿的染色体或基因是否正常，如诊断胎儿患有遗传性疾病或畸形给予选择性流产，防止遗传性患儿的出世，达到优生的目的。

目前产前诊断热点辅助生殖技术中的植入前遗传学诊断（PGD），该方法取样于辅助生殖技术中植入前的胚胎，进行基因检测，排除致病基因的胚胎才移植，避免了选择性流产和多次流产的危害及伦理道德观念的冲突。但该方法也存在一些缺点：1.胚胎存在嵌合型，胚胎中的细胞带有不同的遗传物质，活检获得的单卵裂球并不能代表整个胚胎的基因型。2胚胎可供诊断的物质有限，这些将影响PGD的准确性。3胚胎活检受损或诊断技术（荧光原位杂交或聚合酶链反应）的失败都将影响PGD的成功率，减少妊娠的机会。

孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展.利用母血中胎儿细胞诊断遗传性疾病可望成为最佳非创伤性产前诊断技术.妊娠过程中，胚胎与母体血液间从无直接沟通，胚胎生长发育所需的氧气和营养物质必须通过胎盘屏障吸收，同时也经此途径排出代谢产物。由于绒毛直接浸泡于母血中，因而胎盘屏障容易受到物理化学及免疫等因素的影响而出现损伤，胎儿有核红细胞及游离的DNA因此有可能通过胎盘进入母体循环。因此，在排除血液系统疾病后，妊娠妇女外周血中如果发现有核红细胞，应来自胎儿。胎儿有核红细胞属单个核细胞,含胎儿全部基因组。存在于孕母血液中的胎儿有核红细胞寿命一般不超过100天，与继往妊娠无关，容易通过形态学及特殊的血红蛋白反应进行鉴别，且含量在1：102-1：107之间，只要有适当的方法便足能作遗传学和分子生物学分析。在母体循环中胎儿细胞的数量与胎儿本身产生红细胞的多寡，胎盘的完整性以及母体全身免疫和对胎儿的局部免疫状态密切相关。孕妇年龄、孕次、产次及孕周对母血中胎儿有核红细胞计数均有影响。

母血中胎儿有核红细胞的提取可能因实验方法的不同而有差异。可采用密度梯度离心、荧光激活细胞分选术,磁激活细胞分选术、细胞培养,显微操作分选等方法将胎儿细胞分选富集.现可从基因和染色体两个水平通过母血中胎儿细胞进行非创伤性产前诊断。本实验我们采用了不连续密度梯度离心法及Kleihauer法染色，该方法操作步骤少，减少了细胞丢失及破坏，细胞形态完整，检出率高。在本试验中，正常妊娠时母血中胎儿有核红细胞约为2.1-13.17个/10ml,稍高于以往报道[3]。其中有5例受试者没有检测到Kleihauer染色阳性细胞，可能有以下几点原因：①胎儿个体发育速度有差异，孕7-8周孕妇外周血中可能无胎儿有核红细胞存在。②母体外周血中胎儿细胞数量稀少，在实验中易受各种因素的影响，在操作过程中可能由于细胞破坏，从而检测不到胎儿有核红细胞。

胎儿NRBC首次出现于孕妇外周血中的时间存在个体差异，在不同孕周胎儿细胞数量会发生相应改变。Lee等[4]应用电荷流式分离法对NRBC在不同孕周出现在母血中的频率进行研究发现，在7-25W分离效果较好。Rodriguez等[5]应用双重密度梯度离心和MACS分离胎儿细胞，结果表明，胎儿有核红细胞从孕早期到孕中期逐渐增高，而孕15周是无创性产前基因诊断的最佳孕期。但也有母血中胎儿有核红细胞数量与孕周无关的报道[6]。

本实验结果表明，经Kleihauer染色法能检测到胎儿有核红细胞的最早期为孕8周，自孕8-20周，母血中胎儿有核红细胞数量与孕周有显著直线相关性，母体循环中胎儿细胞的比例随孕龄增加。我们推测,随着胎儿发育成熟，虽然胎儿血液中有核红细胞在全血细胞中所占比例逐渐降低，但与此同时，胎儿的血容量逐渐增加，与母体交换加快；而且，细胞滋养层外壳在胚胎及胎儿发育过程中迅速增殖，使母体循环和胎儿循环间的物质交换面积大大增加。此外，胎盘血流量随妊娠进展逐渐增加。这些可能是母血中胎儿有核红细胞数量随孕周显著增加的主要原因[7]。

[参考文献]

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细胞遗传学检验篇4

关键词：荨麻疹；自身免疫；病因；治疗；现状

慢性荨麻疹指皮肤反复出现一过性（不超过24h）的风团伴瘙痒，病程超过6w以上。自身免疫性荨麻疹（AutoimmuneurticariaAU）是慢性荨麻疹的一种特殊类型，是指功能性自身抗体通过与高亲和性IgE受体（FcεRI）交联，激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，释放组织胺而引起的荨麻疹[1]。现就自身免疫性荨麻疹的发病机制、临床特征、诊断方法和治疗的研究进展综述如下。

1病因与发病机制

多数急性荨麻疹可找到病因，而慢性荨麻疹的病因则很难确定。目前研究表明，自身免疫性荨麻疹的发病与免疫因素、遗传因素与炎症介质等诸多因素密切相关。

1.1免疫学因素

1.1.1抗IgE与IgE受体的自身抗体Grattan等发现部分CU患者皮内注射自体血清，可引起速发型红斑-风团反应，与自然发生的荨麻疹皮疹相似。一些研究表明50%CIU患者血清中存在抗-FcεRI功能性自身抗体，大约只有10%CIU患者血清中存在抗-IgE自身抗体[2]。此外，研究表明在ASST试验阳性患者血清中，IgG1、IgG3的水平低于正常对照，而IgG2水而增高[3]，推测与CU患者Th1细胞反映占优势，产生IFN一γ，进而促进抗-FcεRI自身抗体IgG2高表达，而IgG1、IgG3在免疫反应过程中消耗有关。

1.1.2Th免疫细胞有研究发现[4]，淋巴细胞p21ras信号传导通路存在异常调节，使淋巴细胞的分化异常、功能异常，产生了自身免疫反应。目前普遍认为，在CIU的发病机制中，Th0细胞、Th1/Th2细胞共同起主要作用[5]。Caproni等[6]研究发现CIU的早期反应以Th2为主，晚期以Th1为主。研究发现[7]，在变态反应中，Th2细胞能促进B细胞产生IgE，也可以通过产生IL-4、5、13等细胞因子直接或间接引起变态反应。研究发现[8]CIU外周血中嗜碱粒细胞数量减少，风团内也没有嗜碱粒细胞聚集。推测外周血嗜碱粒细胞减少是源于皮损中嗜碱粒细胞的脱颗粒或细胞破坏，外周血中嗜碱粒细胞数量和荨麻疹严重程度具有负相关性，提示疾病发作时，血液中的嗜碱粒细胞补充到风团损害中。

1.2遗传因素最近的研究显示慢性寻麻疹在其直系亲属中的发病率显著增加，表明其发病与遗传因素有关[9]。O'Donnell等人研究显示，AU患者HLA-DRB1*04（DR4）和其等位基因HLA-DQ8（DQB1*0302）较正常健康对照组出现的频率要高。体内和体外试验表明，携带HLA-DRB1*04（DR4）基因的患者组胺释放的活性增强，而且在自体皮肤血清试验（ASST）阳性以及血清中无组胺释放的患者中，其组胺释放活性的增强更加显著[10]。目前的研究表明，在抗原致敏过程中，某种HLA-Ⅱ类等位基因可能是AU患者发病的危险因素或保护因素[11]。

2临床特征与诊断

目前诊断自身免疫性荨麻疹的金标准是嗜碱性粒细胞或肥大细胞功能性释放测定法，实际上，由于条件所限，大多数临床机构是靠临床表现以及实验室检查来对自身免疫性荨麻疹经行早期诊断。

2.1嗜碱性粒细胞释放组胺活性检测：取健康供体的嗜碱性粒细胞，加入AU患者的血清中培养，检测组胺的释放量。由于从不同个体提取的嗜碱性粒细胞的免疫反应性具有个体差异，从健康成人外周血中提取嗜碱性粒细胞过程复杂繁琐，很难广泛推广，所以一般不作为常规检查。

2.2血清自身抗体检测应用ELISA或免疫印记法检测AU患者血清，常可检测到抗-IgE或抗-FcεRI的自身抗体，以及器官特异性自身抗体如甲状腺特异性自身抗体、抗幽门螺杆菌抗体、抗胃壁细胞抗体、抗平滑肌抗体或抗内皮细胞抗体等。

3治疗进展

3.1一般治疗避免可能加重病情的因素如过热、压力、酒精、阿片制剂、非甾体抗炎药以及食物性过敏原。食入性过敏原包括食品添加剂、水杨酸、以及含有芳香族物质的番茄、白酒和草药等。

3.2药物治疗包括连续的3个阶段。开始使用一线治疗药物（抗组织胺药物），特殊情况下可使用二线药物（包括急性期短程口服糖皮质激素），对于用其他治疗效果不佳的严重患者可给予免疫调节的三线治疗。免疫治疗包括：血浆置换、-干扰素、环孢素、静脉注射免疫球蛋白（IVIGs）和Omalizumab单抗（重组人体单克隆IgE阻滞性抗体）[12]等。

4展望

自身免疫性荨麻疹在发病机制、临床特征、诊断方法和治疗上都有其特殊性，是一种特殊类型的慢性难治性荨麻疹。该病目前尚无统一的诊断标准，尽管目前对于它的研究还不透彻，但是随着遗传学、分子生物学、免疫学的发展，不久的将来有可能在分子水平上研制出有效的针对抗IgE的自身抗体的抗体以利更有效的治疗自身免疫性荨麻疹[13]。

参考文献：

细胞遗传学检验篇5

关键词：安胎丸；骨髓细胞；染色体畸变；遗传毒性；致突变

中图分类号：R273文献标识码：A文章编号：1671-2064（2017）12-0197-02

安胎丸是一种养血安胎的中成药，由当归[2]、白芍、川芎、菟丝子、川贝母、黄芪[2]、荆芥、厚朴、艾叶、积壳、羌活、甘草组成。用于妊娠血虚，胎动不安，面色淡黄，不思饮食，神疲乏力等症。现代多用于先兆性流产，妊娠贫血等[3-4]。由于胎儿细胞分裂、分化发育等非常旺盛，对孕妇用药的遗传毒性有更高的要求。据相关报道称，在遗传毒性试验中出现阳性结果的中药较少，即使有一定的遗传毒性，也大都是在远远高出人们正常服用的剂量下出现的，小剂量并不足以引起危险[5]，以致人们对其安全性的忽略。目前对安胎丸的应用相对广泛，而对其安全性评价相对较少。安胎丸，作为一种孕妇常用中药，对其遗传毒性的评价有较大意义。本文通过小鼠骨髓细胞染色体畸变试验，为其安全性毒理学评价提供依据。

本研究用哺乳动物骨髓细胞染色体畸变的方法，对收集到的部分安胎丸样品（7个厂家的12个批次）的致突变性进行了安全性评价（见表1）。虽然不同的厂家安胎丸的配方基本相同，但所用原材料来源与质量、炮制工艺等可能会有差别，因此我们将收集的样品的全部厂家都列入考察范围。而每个厂家的不同批号间相对稳定性较高，结合工作量进行考虑，本次研究每个厂家选用1-2个批号进行检查。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验样品

安胎丸，规格：每丸重6g。本品为棕色的大蜜丸。人体推荐用量为每日2次，一次1丸，1日12g，按60kg体重这算成0.2g/kg。

1.1.2实验动物

选用NIH小鼠，每组5只，雌雄各半，逐一称重，体重为20g-22g，动物室温温度：22℃～25℃，相对湿度：55%～70%。

1.1.3主要仪器与试剂

仪器：实验室常用仪器、解剖器械、离心机、恒温水浴箱37±5℃、载玻片、生物显微镜。

试剂：0.1%秋水仙素、环磷酰胺、2.2%柠檬酸钠、90%NaCl溶液、甲醇：冰醋酸3：1（现配现用）、0.75mol/LKCl溶液、Giemsa应用液（取1mlGiemsa原液，加入KH2PO4溶液3.6ml，KH2PO4・H2O溶液5.4ml）。

Giemsa原液配制：称取Giemsa染料1.0g于研钵中，加甘油44ml，研磨至无颗粒，56℃水浴保温2h，取出加入66ml甲醇，混匀，滤纸过滤，保存于棕色瓶中备用。

KH2PO4溶液：称取KH2PO4粉0.908g，加超纯水100ml溶解。

KH2PO4・H2O溶液：称取KH2PO4・H2O粉1.187g，加超纯水100ml溶解。

1.2动物分组与剂量设置

在前期预实验的基础上，参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版），选用20g/kgBW的一个剂量组，每天灌胃1次，连续灌胃4天，在末次给受试物后24h取材。处死动物前3h，按4mg/kgBW腹腔注入秋水仙素。另外，设阳性对照和阴性对照，阳性对照选用40mg/kgBW腹腔注射环磷酰胺，阴性对照用同体积的纯化水，给药频率和给药方式与样品相同。

1.3试验方法

（1）用二氧化碳麻醉法处死动物，解剖取出股骨，剔除肌肉等组织。（2）剪去两端骨骺，用注射器吸取4mL2.2%柠檬酸钠从股骨一端冲洗，用10ml离心管收集骨髓细胞悬液。（3）将细胞悬液置于离心机以1500rpm离心10min，弃去上清液，沉淀加4ml0.075mol/LKCl溶液，用滴管轻吹混匀，置37℃水浴箱低渗处理30min。（4）加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），轻轻摇匀，37℃水浴放置10min，然后以1500rpm离心10min，弃去上清液。（5）再加入5ml固定液，轻轻吹打混匀，37℃水浴放置20min，1500rpm离心10min，除去上清液。（6）加入5ml固定液，轻轻吹打混匀，37℃水浴放置20min，1500rpm离心10，min，除去上清液，留约0.5ml固定液，轻轻吹打混匀。（7）从-30℃冰箱中取出冰冻的载玻片，悬空约（50cm）滴片，自然干燥。玻片编号，倒扣于片架。（8）用配制好的Giemsa应用液加满片架凹槽，染色15min，后用清水冲洗干净，晾干，存放于片盒中，以便观察。

1.4显微镜观察

在低倍镜下，每组各选择100个左右分散良好，细胞末破裂的中期分裂相胞，在显微镜油镜下读片进行染色体畸变分析，在读片时记录每一观察细胞的染色体数目，记录染色体畸变细胞在显微镜视野的坐标位置及畸变类型（染色体结构异常：断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙、粉碎化。染色体数目异常细胞：多倍体；非整倍体性畸变；内复制。）

1.5统计学方法

用χ2检验对试验数据进行统计学处理，观察各试验组畸变细胞率与阴性对照组和阳性对照组比较差异是否有统计学意义。

2实验结果与结论

2.1结果

由表2可见，全部样品和全部厂家的平均畸变率均明显低于阳性对照组的平均畸变率（卡方检验均有显著性差异，p

2.2结论

本次实验结果表明，广西梧州三鹤药业有限公司等7个厂家12批次的安胎丸对小鼠骨髓细胞的染色体均无致畸变性。

3讨论

染色体异常也称染色体发育不全，指的是染色体的数目异常和结构畸变。智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。药物对人类的生殖危害是深远的，它不仅对畸形儿本身的生理、心理造成障碍，对患儿家庭乃至整个社会都是沉重的负担，因而，只要有可能造成人畸形的药物都需引起人们的高度重视，以确保妇女用药安全[5、6]。

骨髓细胞染色体畸变分析试验观察的是分裂间期与前期的细胞染色体畸变，与骨髓微核试验不同，能够直接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试物是否具有突变作用[7、8]。在本实验对7个厂家12批次的安胎丸进行安全性评价中，无小鼠死亡，未出现致突变作用，表明安胎丸对哺乳动物染色体可能不具有损伤效应。另外，目前国内已有不少临床报道证实安胎丸在治疗先兆流产方面有显著疗效。安胎丸不仅可以用于治疗先兆流产，也能用于预防流产的发生，服用方便，值得临床推广使用

参考文献

[1]孟紫强，张波.二氧化硫吸入诱发小鼠骨髓细胞染色体畸变的效应[J].中华预防医学杂志，2002，36（4）：229.

[2]张春颖，周钟鸣.常见中成药的致突变性研究进展[J].中国中医药信息杂志.2001，8（3）：20.

[3]王芳，刘晓杭.固肾安胎丸治疗早期先兆流产临床疗效观察[J].中国医院用药评价与分析.2011，11（12）：1121-1123.

[4]刘红梅，张鹏，秦红，刘寨华.固肾安胎丸治疗肾虚型早期先兆流产的临床研究[J].中国中医基础医学杂志，2011，17（10）：1164-1165.

[5]孙于兰.三七、白术、巴戟天的遗传毒性研究[D].四川大学.营养与食品卫生学，2003.

[6]刘世清，熊文，杜予民，丁万军.羧甲基壳聚糖的骨髓细胞染色体畸变试验[J].毒理学杂志，2008，22（1）：70-71.

细胞遗传学检验篇6

CML特异性费城染色体(Philadephia，Ph)是由t(9：22)(q34：11)易位形成。9号染色体原癌基因abl(Abelsonprotooncogene)易位至22号染色体的断裂点簇集区(breakpoint

dusterregion，ber)，发生重排，产生bcr／abl融合基因，引起CML的始动突变。融合基因bcr／abl几乎见于所有的慢性粒细胞性自血病、25％一50％的急性B系淋巴细胞性白血病(ALL)和约5％的急性粒细胞性白血病中J，本文统计了进行染色体和bcr／abl融合基因检查的初诊血液病66例，对其骨髓细胞染色体核型及ber／~l融合基因进行分析。

1资料和方法

1.1一般资料

收集浙江省中医院2007年1月～2010年5月初诊血液病患者66例(男44，女22)，年龄(6―77)岁，平均44岁。其中慢性粒细胞性白血病48例，急性淋巴细胞性

白血病1I例，急性粒细胞性白血病3例，慢性淋巴细胞性白血病1例，淋巴瘤骨髓侵犯1例，白细胞增多症2例，以上病人诊断均参照《血液病诊断及疗效标准》拉J。

1.2仪器与试剂

美国Bio．RAD凝胶成像分析系统，美国ABI公司PE7000实时荧光定量F-CR仪，Thermalcycler480DNA扩增系统，Trizol(invitrogen公司)逆转录试剂盒(上海宝诚生物工程大连有限公司)，引物为杭州晶大生物科技有限公司合成。

1.3染色体标本制备染色体榱本来源骨髓，肝素抗凝，采用直接法或24h短期培养法，收集有丝分裂中期细胞，采用R显带技术分析20个分裂中期细胞，核型分析或异常克隆

描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)(1995)》进行。

1.4bcr／abl融合基因测定取骨髓标本经肝素抗凝，用Ficol1分离液分离单个核细胞。Trrizol、氯仿-异丙醇法提取总RNA，进行RT―PCR，K562细胞株作为阳性对照。RT反应体系如F：RNA2trg，Oligo―dT1’．，DEPC水补足10，70cc5min后加5mmol／LTris―HCI4，,~tNTP(10raM)2，Rnasin(40tr／)O．5，DEPC水1．5，25(=【：5rain，加逆转录酶(M―MLV)1，混匀25~C10min，42℃60rain，70~C10rain。取逆转录产物4进行PCR，扩增程序为：95℃预变性25min，95℃1min、55~C1min、72℃1min，35个循环72~C延伸10min，16~C60min将扩增好的产物电泳，放入凝胶成像系统内扫描。

2结果

66例骨髓样本经显带法检测Ph染色体与RT―PCR方法检测融合基因后发现，45例bcr／abl限性患者中染色体阳性为39例(86.67％)，48例Ph染色体阳性患者中ber／abl阳性有4J0例(83.33％)，阳性总符合率为85.05％。

3讨论

Ph染色体(ber／ab1)是CML的标志物，9号与22号染色体发生遗传物质交换，产生ber／abl融合基因，导致一种异常融合蛋白p210(费城染色体编码融合基因产物)的产生]。由于融合蛋白酪氨酸激酶活性增强，干扰正常细胞程序，抑制细胞凋亡，导致细胞恶变，骨髓祖细胞大量增生，骨髓基质细胞黏附性下降，使大量不成熟的髓细胞释放于外周血，导致CML。CML实验诊断技术有细胞遗传学方法、荧光原位杂交技术、逆转录PCR(RT―PCR)、巢氏逆转录PCR、实时定量PCR法(real―timequantitative，RQ―PCR)等。细胞遗传学方法可识别典型和变异Ph染色体易位，还可检测多种染色体异常，但检测速度较慢、灵敏度较低。PCR方法有高度的灵敏性，可检测出微量的残留肿瘤细胞。Pl1染色体和bcrfabl融合基因检测为CML诊断提供了更为敏感和可靠的指标，但实际检测过程中，应注意标本的送检与处理，对最终结果的解释应结合细胞形态学结果和临床，仔细分析，并可进一步采用FISH技术对骨髓细胞中期分裂相或骨髓涂片直接进行ber／abl融合基因检测，从而给临床治疗和预后判断提供帮助。

参考文献

[1]Kurm~kR，GuttermanJV，T',dpazM．Themoleculargeneticsofphiladelphiachromosomepositiveleukemias[J]．NEnglJMed，1988，

319(15)：990-998．

[2]张之南，沈娣，主编．血液病诊断及疗效标准[M]．第1版．北京：科学出版社，2007，219―227．